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1、0 二8 0 0 8 5 ；分类号：U D C密级：编号：登南大学博士学位论文牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究学位申请人：童一- 静 导师姓名及职称：王鱼堂熬撬一一 专她长繇j 一叠苎愁釜一2 0 0 5年5月8日摘要牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究暨南大学第一临床学院妇产科博士研究生：章韵导师：王自能博士教授中文摘要目的：围产期缺氧缺血| 生脑损伤是导致新生儿致残和死亡的主要原因，本课题在成功建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型基础上，探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤皮质部神经元退行性交方式；以西药胞二磷胆碱为对照，研究中药牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保
2、护作用，并进一步研究其可能的作用机制。方法：1 实验设计析因设计析因设计实验设计方案胞二磷胆碱( C D P C )牛珀至宝丹( r C e Z B D )不用用2 新生大鼠缺氧缺血- I 生脑损伤模型建立及神经元退行性变超微结构研究建立模型：仔鼠在乙醚麻醉下取仰卧位，无菌条件下，颈部正中切口，游离左侧颈总动脉，5 O 丝线做永久性结扎。术后将仔鼠放回母鼠身边恢复1 5h 后，置于已预热的自制低氧舱，体积为2L ，舱内温度控制在3 6 。C 左右。通以体积分数为7 7 氧气+ 9 2 3 氮气的混合气体，流速为1 5 L m i n ，持续6 0r a i n 。实验结束后放回母鼠身边。根椐神
3、经行为学、T I C 染色、光镜下病理变化判断模型建立成功与否。分别在复氧后4h ，2 4h ，7 2h ，1 w 取材，利用电镜技术观察左侧皮质部神经元退行性l暨南大学博士学位论文变方式。3 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用探讨建立模型，按不同窝仔鼠随机配对原则分为对照组、胞二磷胆碱组、牛珀至宝丹组、两药合用组。对照组给予生理盐水灌胃，1 0m l k g ，一天两次；胞二磷胆碱组，给予胞二磷胆碱腹腔注射，4m l k g ，一天一次；牛珀至宝丹组给予牛珀至宝丹悬浮液灌胃，悬浮液浓度为5 5m g 1 】l ，给药容量为1 0m l k g ，每日2 次；两药合用组，同时给予牛珀
4、至宝丹和胞二磷胆碱，给药方式和剂量同上。一 二述各组第一次给药时间均在复氧后3 0m i n 内。测定复氧后7 2h各组脑梗塞体积、损伤侧与对侧脑重比，并利用电镜技术观察左侧大脑皮质神经元的超微结构，以评价牛珀至宝丹对H I B D 新生大鼠的保护作用。4 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血脚卤损伤自由基的影晌建立模型，动物的分组与处理与第3 部分类似，但按取材时间即复氧后4h 、2 4 h 、7 2h ，每组再分为三个亚组。采用生化技术测定复氧后4 h 、2 4 h 、7 2 h 各组左侧脑组织S O D 活力、M D A 及N O 的含量。5 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血呦卤损伤神经细胞凋亡及C
5、 a s p a s e - 3 表达的影响建立模型，动物的分组及处理与第3 部分相同。复氧后7 2h ，一部分动物的脑组织行组织切片，用于T U N I E L 染色观察各组皮质损伤区神经细胞凋亡情况，及免疫组化染色分析C a s p a s e - 3 、细胞色素c 蛋白表达情况：一部分动物的脑用于提取左侧脑皮质总R N A ，采用R T - P C R 技术测定c a s p a s e 一3m R N A 及c a s p a s e , - 1 2m R N A 的相对含量。6 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血脚卤损伤神经细胞线粒体及内质网凋亡途径的影响建立动物模型，动物的分组及处理与第
6、3 部分相同。测定线粒体凋亡途径上细胞色素C的蛋白表达水平，及内质网凋亡途径上c a s p a s e 1 2 的转录水平，方法见5 。结果：1 新生大鼠缺氧缺血呦窗损伤模型建立及神经元退行性变超微结构研究7 日龄仔鼠缺氧缺血后神经行为学表现为自发性左旋，右侧肢体瘫痪，T T c 染色见左侧半球( 损伤侧) 呈苍白色，右侧( 对侧) 为红色；光镜下大脑皮质、海马出现病理变化；神经元退行性变形式包括坏死、杂合体、凋亡、脂性退变及暗细胞。2 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的探讨I I摘要2 1 牛珀至宝丹对脑梗塞R 4 P , 的影响牛珀至宝丹与胞二磷胆碱均有减少脑梗塞体积的作用(
7、 分别为F = 2 6 2 1 2 ，P = 0 0 0 0 ；庐1 2 9 5 1 ，P - - 0 0 0 1 ) ；牛珀至宝丹组( 2 2 7 6 - + - 2 7 0 ) 、胞二磷胆碱组( 2 4 6 7 3 7 9 ) 与对照组( 3 1 8 7 + 5 5 5 ) 相比，差异有统计学意义妒值均为O 0 0 0 ) 。两药的交互作用有统计学意义( P = 4 6 3 1 ，P = 0 0 3 8 ) ，两药合用组脑梗塞体积( 2 0 9 5 3 1 9 )分别比牛珀至宝丹组、胞二磷胆碱组下降了7 9 5 ，1 4 ，9 6 ，可认为牛珀至宝丹与胞二磷胆碱两药降低脑梗塞体积的交互作用
8、为协同作用。2 2 牛珀至宝丹对损伤侧与对侧脑重比的影响牛珀至宝丹与胞二磷胆碱均有提高损伤侧与对侧脑重比的作用( 分别为罔7 4 7 ，p = -O 0 0 4 ；F = 1 1 8 5 3 ，P 劬0 0 2 ) ，与对照组( O 8 5 0 0 5 ) 相比，牛珀至宝丹组( o 9 3 4 - 0 0 4 ) 、胞二磷胆碱组( o 9 2 O 0 3 ) 差异有统计学意义( 分别为P = 0 0 0 0 ，0 0 0 1 ) ，分别提高了9 4 1 ，8 2 3 。两药的交互作用有统计学意义( 胆4 3 4 5 ，P = 0 0 4 5 ) ，两药合用组( 0 9 4 + 0 0 3 )
9、与牛珀至宝丹组、胞二磷胆碱组相比，分别提高了1 0 7 2 1 7 ，可认为牛珀至宝丹与胞二磷胆碱对提高损伤侧与对侧脑重比的交互作用为协同作用。2 3 牛珀至宝丹对神经元超微结构的影响两药均对神经元细胞器有较好的保护作用，尤其体现在线粒体与内质网的保护作用上。3 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血I 生脑损伤自由基的影响3 1 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织S O D 、M D A 、N O 水平的动态变化S O D 活力在复氧后4 h 、2 4 h 呈一低迷状态，M D A 7 K - Y 显著增加，至2 4 h 达一峰值( 9 0 8 11 6 9 6 ) ，与4h ( 7 5 9 7 - t
10、- 1 3 0 1 ) 相比，差异统计学意义( P - - o 0 4 5 ) 。随着日龄的增长，S O D活力渐显提高趋势，复氧后7 2 h ( 1 9 7 7 4 _ + 5 6 2 3 ) 与4 h ( 1 4 7 3 2 + 2 2 ，6 6 ) 、2 4 h ( 1 5 5 2 6 2 0 2 9 )相比，差异有统计学意义( 分别为p 司0 1 4 ，0 0 4 1 ) ；伴随S O D 活力的提高，M D A 水平下降，复氧后7 2 h ( 6 7 3 4 + 1 0 3 6 ) 与2 4 h ( 9 0 8 1 1 6 9 6 ) , f H L t ，差异有统计学意义( P -
11、 - O 0 0 3 ) 。N O 水平在复氧后4 h ，2 4 h ，7 2 h 均升高，于4 h 达一峰值后，有所下降，至7 2 h 又达一峰值，且复氧后7 2 h 的N O 水平0 3 5 6 9 + _ _ 3 1 9 8 ) 明显高于4 h ( 9 7 4 1 3 5 8 3 ) 、2 4 h ( 7 8 1 91 9 7 9 ) ，差异均有统计学意义( 分别为P = - 0 0 4 4 ，O 0 0 5 ) 。3 2 牛珀至宝丹对新生大鼠缺氧缺血。呦卤损伤S O D 、M D A 、N O 水平的影响I I I暨南大学博士学位论文复氧后4h 、2 4h ，牛珀至宝丹与胞二磷碱均表现
12、出提高脑组织S O D 活力( p 0 0 5 ) ；但两药仍有降f 氐此时M D A 水平的效应( P o 0 5 ) B u ta tt h et i m e ，t h et w od r u g sc o u l dd e c r e a s e dt h el e v e lo fM D A ( P o 0 5 ) 。这些研究结果提示，与胞二磷胆碱相比，牛珀至宝丹除了具有清除氧自由基的能力，更表现出降低N O 水平的效应。所以我们推澳j 牛珀至宝丹对缺氧缺血所诱导的新生大鼠脑损伤的保护作用机理可能是：在缺氧缺血后早期通过提高S O D 活力、降1 氐M D A 水平，在迟发阶段通过降f
13、 氐N O 水平达保护脑损伤的效应。由于在损伤早期可有效清除氧自由基，提示损伤后即刻应用牛珀至宝丹可延长治疗时间的窗口期，并与胞二磷胆碱具有协同作用。作为自由基清除剂，牛珀至宝丹是通过何种方式产生效应的? 根据文献报道，一些抗氧化剂在新生动物H I B D 中有神经保护或神经元援救效应，如黄嘌呤氧化酶抑制剂A l l o p u f i n o l ，预防性给药可减轻新生大鼠组织学损伤，而且治疗性给药其保护效应仍然明显口，然而最近暨南大学博士学位论文研究表明 踟：另一种黄嘌呤氧化酶抑制剂O x y p u r i n o l 对缺氧缺血性脑伤的新生大鼠治疗J | 生给药却没有保护作用。O x
14、y p u r i n o l 是A l l o p u r i n o l 的代谢物，常用来治疗尿酸血症。由于尿酸是细胞内重要抗氧化剂之一，研究者怀疑复氧期间人为减少尿酸浓度，特别对于新生儿，是否有害? L k d e a 等嗍的研究表明，常用于成人治疗的一种自由基清除剂3 - m e t h y l - 1 - p h e n y l - 2 - p y r a z o l i n - 5 - o n e ( M C I - 8 6 ) ，对7 日龄H I B D 大鼠治疗性给药，采用T T C染色和组织学损伤的评分方法，发现它也对新生动物也表现出明显的保护作用，并呈剂量依赖性。D e f
15、 e r o n x a m i n e ，一种铁螯合剂，也被证明有神经元保护作用和援救效应。尽管维生素C 和E 是人们所熟知的抗氧化剂，但是它们与改善缺氧缺血的动物模型的脑组织不相关的。牛珀至宝丹作为自由基清除剂可能与其直接抑制黄嘌呤偿棵呤氧化酶系统有关 g J l 。对于对N O 的抑制作用，牛珀至宝丹是何种方式进行调节的呢? 廖欣等M 采用免疫组织化学方法，研究N O S 三种亚型在局灶性脑缺血后大鼠脑组织的表达情况，结果提示牛珀至宝丹对缺血性脑损伤保护作用，一方面是i 勘丑抑制脑缺血后i N O S 和n N O S 过度表达，5 犟f 氐源于i N O S 和n N O S 过度表达
16、所形成的N O 神经毒性；另一方面，上调脑缺血后e N O S ，提高源于e N O S 产生的N O 神经保护作用，表明牛珀至宝丹对N O 的双重调控作用。目前N O S抑制剂包括选择眭和非选择两类，如7 硝基吲唑( 7 - n i l r o i n d a z o l e ，7 - N 0 为n N O S 的选择性抑制剂，氨基胍( A m i n o g u a n i d i n e ) 为i N O S 选择性抑制剂；非选择性抑制剂如L - 精氨酸( L - A r g )同类物：L - N G 硝基精氨酸( L - N N A ) 、L N G - 硝基一精氨酸甲酯( L - N A M E ) 、L - 单甲基一精氨酸( L - N M M A ) 。这两类抑制剂所产生的效应不一，非选择性抑制剂对缺血性脑伤有混
