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1、实验步骤实验步骤-参考参考 205 Covalent Coupling-羧基修饰微球羧基修饰微球1、1ml 微球（100mg/ml）在 10ml 激活缓冲液激活缓冲液清洗 2 次。2、第二次清洗后，微球重悬于 10ml 激活缓冲液，确保微球悬浮（辅助手段：涡流、声波降解、滚动），此时微球悬液的浓度为 10mg/ml。3、混合时添加 100mg WSC（添加 WSC 可能会引起凝结成块，一般不大引起关注，应当通过孵化与生物分子解决）。4、室温（18-25）下连续搅拌 15min。5、耦合缓冲液耦合缓冲液洗 2 次，重悬于 5ml 耦合缓冲液，如第二步，尽可能确保颗粒悬浮。6、在 5ml 耦合缓冲
2、液耦合缓冲液溶解蛋白（1-10X 过量单层），结合微球悬浮和蛋白解决方案。7、室温下连续搅拌 2-4h。8、清洗 重悬于 10ml 淬灭溶液，轻轻混合 30min，清洗，重悬于贮存缓冲液进行保存（理想的贮存浓度通常是 10mg/ml）。9、4保存。激活缓冲液-MES 或 DIW -羧基乳胶微球 pH?耦合缓冲液-MES/DIW贮存缓冲液是什么？贮存缓冲液和清洗微球的缓冲液应保持一致。实验方法：共价结合实验方法：共价结合-生成生成 NHS 中间活化酯二步法中间活化酯二步法Water-soluble sulfo-N-hydroxysuccinimide can be added to increa
3、se coupling efficiency. The active ester intermediate formed by the N-hydroxy compound will replace the o-acylisourea intermediate formed by the WSC (unstable), is more stable to hydrolysis, and yet still highly reactive toward amines on the protein to be coupled. 此方法中，在 EDC 存在下，NHS 通过与微球上的羧基反应形成中间活
4、化酯。活化酯比EDC 更稳定，不易水解。NHS / Sulfo-NHS 可提高偶联效率。实验步骤实验步骤Bead activation1、 A 方案：每方案：每 ml 反应混合物加入下列各物：反应混合物加入下列各物：a 0.1mL 10x 的 Activation Buffer（10x 的 MES buffer 通常用 0.5M），其 pH 值为 6.0-6.5；Buffer 的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用 Buffer 有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES 缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。在这种情况下，抗体也
5、更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。然而，最终 Buffer 的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同 pH 的反应 Buffer 应该进行优化选择。起始实验，反应反应 Buffer 的离子强度应该在的离子强度应该在 2550mM。b 0.1mL 10%的微球（100mg/ml），胶乳微球最终浓度为 1%（w/v,10mg/ml）；c 0.23mL 的 50mg/mL 的 NHS 的去离子水溶液；11.5mgd 一定体积 19.2mg/mL（100mM）的 EDC 的去离子水溶液。 EDC 的用量，根据微球表面羧基浓度来计算。根据计算所需量，每 mo
6、l 的羧基应该再多加 23mol 的EDC。但是，根据功能性检测结果，还需要进一步的优化。e用去离子水（DIW）最后定容为 1.0mL；1、 B 方案：每方案：每 ml 反应混合物加入下列各物：反应混合物加入下列各物：a、0.1mL 10%的微球（100mg/ml），胶乳微球最终浓度为 1%（w/v,10mg/ml）； 在 1ml Activation Buffer（一般可用 0.5M MES 缓冲溶液）清洗 2 次。微球置于干净的离心管（离心 10000rpm5min）Tip 头小心弃上清 第二次清洗后，微球重悬于一定体积 Activation Buffer，确保微球悬浮。重悬辅助手段：涡流
7、、声波降解、滚动等，此处将离心管在超声波下声浴 60s。b、0.23mL 的 50mg/mL 的 NHS 的去离子水溶液；11.5mgc、一定体积 19.2mg/mL（100mM）的 EDC 的去离子水溶液；d、Activation Buffe 最后定容为 1.0mL。2、 在室温（在室温（18-25）搅拌反应）搅拌反应 15-30 分钟分钟 Or 漩涡混匀，室温下，在旋转混合器或轻微涡流或振荡器上放置漩涡混匀，室温下，在旋转混合器或轻微涡流或振荡器上放置 2 小时。小时。此步骤，微球的凝集经常能观察到！因为接下来的步骤中，EDC 会将相邻两个微球上的抗体连接起来，从而引起微球凝集或者中和微球
8、表面的羧基或者两者情况都发生。调节 pH 到 6.5 或超过 6.5，优化共价反应，对微球的分散有帮助。如果反应结束后微球凝集现象仍然发生，用新鲜的 buffer 清洗除去多余的 EDC 和游离的蛋白，一般会使得凝集颗粒再分散。如果在最终的产品中凝集依然发生，尝试稀释微球，一开始可以稀释到原来的 50%浓度。如果稀释后凝集依然发生，可以尝试在所有 Buffer 中加入 Tween20 或 Tergitol NP9 等非离子型表面活性剂。这些表面活性剂不会干扰颗粒的活性或共价结合，但是需要注意的是，要确保在这种表面活性剂存在下微球共价结合的抗体的稳定。3、 离心 10000 rpm5min，小心
9、弃去上清。Coupling the capture molecule to the activated beads4、 Coupling Buffer 清洗清洗 用用 MES 缓冲液或缓冲液或 DIW 洗涤胶乳微球悬浮物两次；洗涤胶乳微球悬浮物两次；目的：除去未反应的 NHS 和 EDAC移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于 0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的 buffer 应该和storage bu
10、ffer 一样。用于清洗的 buffer 的任何缓冲液成分及 pH 的改变，都会引起蛋白的脱落。5、 重新将胶乳微球在重新将胶乳微球在 Coupling Buffer 中悬浮中悬浮，使其浓度为，使其浓度为 1%（w/v）；）；6、同时，用同时，用 Coupling Buffer 稀释结合蛋白（稀释结合蛋白（1-10x 过量单层）。过量单层）。buffer 一般为一般为pH79，50-100mM，最终的浓度为，最终的浓度为 1mg/mL；7、 稀释完微球后，立即加入稀释完微球后，立即加入 1mL 的蛋白溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度的蛋白溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为分别为
11、 0.5%（w/v）、）、0.5mg/mL、25-50mM）；）；蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。小体积的话，可以进行涡旋混合。当大体积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。8、 将混合物置于水平振荡器，室温轻震将混合物置于水平振荡器，室温轻震 2 小时；小时；9、 按按 1mL 反应混合液加入反应混合液加入 2.5L/1L 乙醇胺混合，搅拌反应乙醇胺混合，搅拌反应 10-30 分钟；分钟；Quenching Solution-乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应。10、清洗、清洗 ，storage buffer 清洗两次。（清洗两次。（N
12、ote 3/4）除去未结合的蛋白质和乙醇胺。11、重悬于适宜浓度的、重悬于适宜浓度的 storage buffer（通常是（通常是 10mg/ml）。）。12、4保存。保存。缓冲液缓冲液 Activation Buffer: MES Coupling Buffer:MES or DIW Storage Buffer:DIW or PBS？The buffer should not contain certain compounds that will interfere or compete with the reaction or ligand. For example, phosphate
13、 and acetate buffers can reduce the reactivity of carbodiimides, and are thus not recommended for use as activation buffers when coupling to COOH-modified microspheres. A popular alternative in this instance is MES. Also, buffers containing free amines, such as Tris or glycine, should be avoided whe
14、n working with amine reactive chemistries.BlockersBlocking agents are often coated on beads (via adsorption) following the coupling reaction. These compounds are used to minimize nonspecific interactions between the coated bead and non-target molecules in the sample.Blockers are often added to the s
15、torage buffer in varying amounts, standard concentrations being anywhere from 0.05% to 0.1% (w/v).技术说明技术说明1微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变； 单位质量的微球表面积（m2/g） ： A/M = 6/PD 其中 D= 微球粒径（m） P = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml) 例如：0.8m 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.050.8 = 7.14 m2/g 1.6m 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.051.6 = 3.57 m2/g 2虽然疏水性吸附与缓冲液 pH 值无关，但反应缓冲液的 pH 值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点 pH 值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用； 3绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。聚苯乙烯乳胶微球的性质聚苯乙烯乳胶微球的性质（1）折射率 Refractive Index 589nm 下 1.59（2）密度 1.05g/cm3 （3）玻璃转化温度 Glass Transition 95
