《MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、MTT 的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT 法)3：选择对数生长期细胞，用 0.25胰酶消化 58min，调整细胞浓度为 5104/mL 加于 96 孔培养板，每孔 100L，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL） ，并设置
2、培养液对照。置 37，体积分数为 5CO2 条件下培养 5672h，于结束前 4h 加入 MTT10L/孔，4h 后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100L/孔，振荡 10min 左右，置酶标仪测 A 值，波长为 570nm。用含 15小牛血清的 1640 培养液将 801-D 细胞或肿瘤细胞接种于 96 孔板，每孔100?l，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5102、1103、5103、1104、2104、5104孔。置 37、5CO2 饱和湿度培养 72 小时，弃上清。每孔加 MTT 20?l(浓度 5?mgml)，继续培养 4 小时。加 100?l DMSO，平板振荡器上震
3、荡 5 分钟，在酶标仪上以 570?nm 波长检测。脾 T 淋巴细胞增殖反应测定4脾细胞（2.5105/孔）在 37，5% CO2 培养条件下，用 10ug/ml gD 蛋白（阴性对照组为 RPMI1640 培养基；阳性对照组为 5ug/ml PHA）刺激 3 天。加入 10ul MTT(5mg/ml)，37继续培养 4 小时后，每孔加入 100ul DMSO 溶解 formazon。检测各孔 490nm 光吸收 值（每一组设 3 个重复孔） ；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。3.1.1 MTT 法3.1.1.1 原理当 T 淋巴细胞受 ConA、PH
4、A 等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解 将 MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formaZan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 丁器和材料RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2 基乙醇(2ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐、异丙醇、MTT、Hanks 液、PBS 缓冲液(pH7.2-7.4)200 目筛网、24 孔培养板，96 孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、 联免疫检测丁、超净工作台3.1.1.3 实验步骤完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入 10小牛血清，
5、1谷氨 胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及 5105mol/L 的 2 基乙醇，用无菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的 NaOH 调 pH 至 7.07.2，即完全培养液。ConA 液 用双蒸水配制成 100ug/mL 的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(20)保存。无菌 Hanks 液 用前以 3.5的无菌 NaHCO3 调 pH7.27.4。MTT 液 将 5mgMTT 溶于 1mL pH7.2 的 PBS 中，现配现用。性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入 4mL 1mo1/L 的 HC1，临用前配制。3.1.1.3.2 脾细胞悬液
6、制备无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经 200 目筛网过滤，用 Hanks 液洗 3 次，每次离心 10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于 2mL 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95以上)，调整细胞浓度为2106 个/mL。3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 1mL，一孔加 50ul ConA 液(相当 5ug/mL)，另一孔作为对照，置 5CO2，37培养 72h。培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清液 0.7mL不含小牛血清的 RPMI1640 培养液，同
7、时加入 MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1mL性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到 96 孔培养板中，每个孔分装 36 孔作为平行样，用 联免疫检测丁，以 570nm 波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 1mL 比色杯中，在 721 分光光度计上比色测定，波长 570nm。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析进行数据统计。用加 ConA 孔的光密度值减去不加 ConA 孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。小鼠 18 只,随机分为三组,连续给药 7 天,
8、于末次给药次日脱颈处死小鼠,无菌取了脾脏,在HANKS 液中,用 100 目钢网和注射器芯研磨,经尼龙布过滤使之成为单个脾细胞悬液,计数后,用含灭活小牛血清的 1640 培养液配成 2.510ml,加入 96 孔平底培养板中,每孔加20lConA 或 LPS，ConA 终浓度为 5g/ml，LPS 终浓度为 10g/ml，每组三个复孔，并设相应对照孔，37C，5%CO2 100%湿度下培养 72 小时后，每孔加入 5mg/ml 的MTT10l ,37C 孵育 4 小时,取出后,离心去上清,每孔加入 200l 酸化异丙醇,静置 15 分钟,待细胞代谢 MTT 形成的 MTT 甲充分溶解,用酶标仪
9、测 0D 值,测定波长 570nm. 1.3 检测指标及方法1.3.1 淋巴细胞增殖反应3：无菌制备小鼠脾细胞悬液，用 RPMI-1640 不完全营养液洗涤 2 次，1000 r/min 离心 10 min，然后用完全营养液配成 5106/ml，取 100 l 加入 96孔细胞培养板内(每孔含 5105/ml 个细胞)，加入终浓度为 5 g/ml 的 ConA, 37，5% CO2 培养箱中培养 48 h 后，每孔加入 10 l MTT 溶液(5 mg/ml)，再继续培养至 12 h，然后加入 DMSO 100 l，充分振荡后静止 20 min，用检测波长 560 nm 全自动酶标仪进行比色分
10、析。1.3.2 IL-2 的诱生：取上述已制备的脾细胞悬液 5106/ml，放培养瓶中 37，5% CO2培养箱中培养 40 h，离心收集上清液，-20冰箱保存备用。1.3.3 制备活化的脾淋巴细胞5：按上法取正常 Balb/C 小鼠无菌取脾脏，制成5106/ml 细胞悬液，加入 ConA 使其终浓度为 5 g/ml，置 37，5% CO2 培养箱中培养 48 h，收集细胞，离心洗 2 次，用完全 RPMI-1640 配成 5105/ml 细胞悬液，作为测IL-2 的反应细胞。1.3.4 IL-2 活性检测：取-20保存的 IL-2 上清，并做 1/2 和 1/4 的稀释，在 96 孔平底培养
11、板中，每孔加入 IL-2 上清原液或不同稀释度的 IL-2 上清 100 l，以及上述反应细胞 100 l；阴性对照不加 IL-2 上清，加 100 l 1640 培养液，各没 4 复孔。于 37，5% CO2 培养箱培养 48 h，每孔加 MTT(5 mg/ml)10 l，继续培养 4 h，吸弃 100 l 上清，加入酸化异丙醇 100 l(0.04 mol/L、HCl-异丙醇)，充分振荡后静止 20 min，用检测波长 560 nm HCl 全自动酶标仪进行比色分析。1.4 结果处理：实验结果采用组间均数差异性 t 检验的方法进行统计分析。第四节 细胞计数及活力测定 一、原理 培养的细胞在
12、一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计） 2、试剂：0.4台盼兰，
13、0.5四甲基偶氮唑盐（MTT） 、酸化异丙醇 3、材料：细胞悬液 三、操作步骤 （一）细胞计数 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置 3 分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml4 大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 （二）细胞活力 1、将细胞悬液以 0.5ml 加入试管中。 2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染
14、色 2 一 3 分钟。 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 （三）MTT 法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT 分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 l、细胞悬液以 1000rpm 离心 10 分钟，弃上清液。 2、沉淀加入 0.51ml MTT，吹打成悬液。 3、37下保温 2 小时。 4、加入
15、 45 ml 酸化异丙醇（定容） 。打匀。 5、1000 rpm 离心，取上清液酶标仪或分光光度计 570nm 比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 第五节 细胞的分裂指数 一、原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：CO2 培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管 2、试剂：培养液、胰酶、
16、甲醇、冰醋酸、Giemsa 染液 三、操作步骤 1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 2、CO2 培养箱中培养 48 小时，使细胞长在盖片上。 3、取出盖片，按下列顺序操作： PBS 漂洗 3 分钟甲醇：冰醋酸=3：1 固定液中固定 30 分钟Giemsa 液染色 10 分钟自来水冲洗。 4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 5、计算: 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数100% 四、注意事项;操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 第六节 细胞周期的测定 一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用 BrdU 渗入测定细胞周期的方法。 BrdU（
