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1、抚顺师范高等专科学校1抚顺师范高等专科学校学生毕业论文题目：辣酱中微生物的检测 专业：生物实验技术 班级：08 生技班 姓名：于冬 抚顺师范高等专科学校2摘要 辣酱根据附加材料的不同可以分为很多品种，包括牛肉酱；香辣银鱼；鲜肉丝油辣椒；鲜鸡丝油辣椒；鲜牛肉油辣椒；豆瓣油辣椒；辣子虾；脆脆香油辣椒等。辣酱品牌众多，因为辣酱越来越成为人们生活中佐料或下饭的必备之物，尤其在尚辣的南方地区。比较出名的辣酱品牌有贵州的老干妈、香港李锦记、湖南的辣妹子等等。本文介绍了辣酱产品的分类、微生物指标要求、试验方法、检验规则等。工厂微生物检测的主要项目为菌落总数、大肠菌群、大肠杆菌等。 微生物检验的计数法有很多种
2、，本文主要介绍平板计数法。关键词：辣酱，菌落总数，大肠菌群，大肠杆菌。 1.1.文件综述文件综述 1.11.1 辣酱的营养辣酱的营养 辣酱中含有的营养数值热量 (59.00 千卡) ，蛋白质 (3.60 克)， 脂肪 (2.40 克)， 碳水化合物 (12.90 克) ，膳食纤维 (7.20 克)， 维生素 A (417.00 微克)， 胡萝卜素 (2500.00 微克)， 硫胺素 (0.02 毫克) ，核黄素 (0.20 毫克)， 尼克酸 (1.50 毫克)， 维生素 E (13.62 毫克)， 钙 (207.00毫克)， 磷 (37.00 毫克)， 钠 (1268.70 毫克)， 镁 (3
3、3.00 毫克)， 铁 (5.30 毫克)， 锌 (0.20 毫克) ，硒 (30.39 微克)， 铜 (0.13 毫克) ，锰 (0.34 毫克)， 钾 (234.00 毫克) 。1.21.2 辣酱营养分析：辣酱营养分析： 辣椒里有一种主要由辣椒碱和二氢辣椒碱构成的辣椒素，这种辣椒素产生的辛辣味，在口感上广泛受到喜爱； 辣椒不仅有好的口感，所含的营养成份也十分丰富，还能刺激唾液和胃液分泌，使人增进食欲，促进人体血液循环、散寒驱湿。能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。有时不表现临床症
4、状，成为隐性传染或带菌状态，有时则表现出临床症状。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另抚顺师范高等专科学校3方面还取决于机体的抵抗力即免疫力. 1.31.3 香辣酱生产加工工艺香辣酱生产加工工艺 辣椒检验去蒂皮籽分离粉碎辣椒粉备用；菜油熟制恒温油炸花生炸制豆瓣酱、豆豉加入其他辅料熟制加入搅拌装瓶放盖入笼蒸煮取笼旋盖蒸煮成品注：该工艺中可选用 2-4 种香精进行配合，风味效果就比较好。1.41.4 微生物生长的几种检测方法微生物生长的几种检测方法 1.4.11.4.1 生长量测定法生长量
5、测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。称干重法：可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的 10-20%。比浊法：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。菌丝长度测量法等。 1.4.21.4.2 微生物计数法微生物计数法微生物计数法常用的有血球计数板法，染色计数法，比例计数法，液体稀释法，试剂纸法等。本文主要介绍平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培
6、养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径 9cm 的平板上出现 50-500 个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。 2.2.实验部分实验部分 2.12.1 菌落总数的检测菌落总数的检测2.1.12.1.1 设备和材料设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温抚顺师范高等专科学校4培养箱：36 1 ，30 1 。冰箱：2 5 。恒温水浴箱：46 1 天平：感量为 0.1 g。均质器。 振荡器。无菌吸管：1ML（具 0
7、.01 ML 刻度） 、10ML（具 0.1 ML 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量 250 ML、500 ML。 无菌培养皿：直径 90 mm。 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。放大镜或/和菌落计数器。 2.1.22.1.2 培养基和试剂培养基和试剂 平板计数琼脂培养基，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水。2.1.32.1.3 操作步骤操作步骤 1.样品的稀释：称取辣酱样品 25 g 置盛有 225 ML 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 ML 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍
8、打 1 min2 min，制成 1:10 的样品匀液。 2.用 1 ML 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 ML，沿管壁缓慢注于盛有 9 ML 稀释液的 无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面） ，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混 合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 3.按 2 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 ML 无菌吸管 或吸头。 4 .根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液） ，在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 ML 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个
9、平皿。同时，分别吸取 1ML 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 5.及时将 15 ML20ML 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1 恒温水浴箱中 保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6. 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养 48 h2 h。水产品 30 1 培养 72 h3 h。.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层 琼脂培养基（约 4 ML） ，凝固后翻转平板，按 1 条件进行培养。 抚顺师范高等专科学校57 .菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落
10、计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 （1）选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 （2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。 （3） 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 8. 结果与报
11、告 菌落总数的计算方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（ML）样品中菌落总数结果。2.22.2 大肠菌群和大肠杆菌的检测大肠菌群和大肠杆菌的检测 2.2.12.2.1 设备和材料设备和材料 吸管：1mL，具 0.1mL 刻度；5mL 和 10mL，具 1mL 刻度。水浴箱：44.50.5。培养箱：361，44.50.5。冰箱：05和-15-20均质器。乳钵和研棒。平皿：直径 90mm。天平：感量 0.1g。显微镜。稀释瓶：100mL、200mL 和 500mL 三角烧瓶及广口瓶。玻璃珠：直径约 5mm。菌落计数
12、器。2.2.22.2.2 培养基及试剂培养基及试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤。煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 EC 肉汤。伊红美蓝琼脂(EMB)。营养琼脂斜面。色氨酸肉汤。MR-VP 培养基。 氏枸椽酸盐肉汤结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。生理盐水。革兰氏染色液。Kovacs 氏靛基质试剂。甲基红指示剂。Vogespros kauer(VP)试剂。 抚顺师范高等专科学校62.2.32.2.3 样品制备样品制备. . (1)以无菌操作取有代表性的样品。用 75乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15保存；非冷冻而易腐
13、的食品，应置于4冰箱保存。检验前冷冻样品可于 2518h 内解冻，或在 45以下 15min内解冻。 (2)样品匀液的制备以无菌操作取 25g 样品，放入装有 225mL 稀释剂的灭菌均质杯内，于 8000rmin 均质 12min，制成 1：10 样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 (3) 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如 10-2、10-3、10-4.。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过 15min。 2.2.42.2.4 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 （一） 大肠菌群 MPN 值的测定 （1）对每个样品，选择适宜的三
14、个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤，每管接种 1mL。 （2）将接种管置于 361培养 482h。 （3）观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在 24h 和48h 内产气的 LST 肉汤管数。如所有 LST 肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。 （二） 大肠菌群的证实试验 （1） 将所有产气管用直径为 3mm 的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。 （2）置 BGLB 肉汤管于 361培养 482h。（3）记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。 （4） 结果报告：按 BGLB 肉汤产气管数，
15、查 MPN 表(见附录 B(补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的 MPN 值。 （三）结果报告： 按产气管数，查 MPN 表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的 MPN 值。 2.2.52.2.5 大肠杆菌测定大肠杆菌测定 抚顺师范高等专科学校7（1）上实验中的 EC 肉汤管继续培养 24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，361培养 242h。 （2） 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 （3） 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36
16、1培养 1824h。 （4 ）将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 a.色氨酸肉汤：在 361培养 242h 后，加 Kovacs 氏试剂0.20.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。 b. MRVP 培养基；在 361培养 482h。以无菌操作移取培养物 1mL至 13mml00mm 试管中，加 5萘酚乙醇溶液 0.6mL，40氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置 2h，如出现伊红色，为 VP 试验阳性。 将 MRVP 培养物的剩余部分再培养 48h 滴加 5 滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。 c.氏枸椽酸盐肉汤：于 361培养 96h 记录有无生长。 d. LST 肉汤：于 301培养 482h，观察试
