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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 韦曦 凌均棨 刘路 作者单位：1.中山大学光华口腔医学院附属口腔医院 正畸科；2.牙体牙髓科，广东 广州 510055 【摘要】 目的 研究人牙周韧带细胞（PDLCs）和牙髓细胞（DPCs）表型特征以及体外传代对其表型特征的影响，为选择适宜的表面标记分选生物性状同源性的细胞亚群提供依据。方法 采用酶消化法体外培养 PDLCs 和 DPCs，免疫组化检测和流式细胞仪分析细胞表面标记的表达。结果 PDLCs 和 DPCs 的 STRO-1 和 CD146免疫组化染色阳性。流式细胞仪分析显示：获得的第 1 代 PDLCs和 DPCs 表达间充质干细胞表面标记
2、 STRO-1、CD146、CD29、CD44 和 CD106，基本不表达 CD34。PDLCs 的STRO-1、CD29 和 CD44 阳性表达百分比与 DPCs 间的差异无统计学意义（P0.05） ，PDLCs 的 CD106 阳性表达百分比高于DPCs，CD146 阳性表达百分比低于 DPCs，且差异有统计学意义（P0.05）. PDLCs expressed significantly higher level of CD106 and significantly lowerlevel of CD146 than DPCs（P0.05） 。第 1 代 PDLCs 的 STRO-1、CD
3、29 和 CD44 阳性表达百分比与 DPCs 间的差异无统计学意义（P0.05） ，PDLCs 的 CD106 阳性表达百分比高于 DPCs，CD146阳性表达百分比低于 DPCs（P0.05） ，其余各代细胞之间的差异均有统计学意义（P0.05） 。3 讨论成体 PDLCs 和 DPCs 中存在高度增殖和多向分化潜能的干细胞。目前，牙源性成体干细胞的鉴定和分选多采用 BMSCs 的表面标记，BMSCs 的表面标记抗原具有非特异性，表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面抗原 STRO-1、CD146、CD29、CD44 和CD106 等。其中 STRO-1 是 BMSCs 和幼红细胞前体细胞
4、表达的细胞表面蛋白，对于 STRO-1 阳性的细胞，其成纤维细胞克隆形成单位（the frequency ofcolony forming units-fibroblasts，CFU-F）显著增加，能够分化形成多向间质细胞系4。因此，STRO-1 被认为是间充质干细胞标记，被广泛应用于 BMSCs 的纯化和鉴定。研究表明，STRO-1 阳性细胞群落表现出高度的增殖活力以及多向分化的潜能，显示出较均一的生物性状2，5。Yang 等6-7证实 STRO-1 阳性的牙髓细胞群具有更确定的多系分化潜能，STRO-1 阳性和未分选的牙髓细胞能够分化形成成牙本质细胞，STRO-1 阴性的牙髓细胞群显示KK
5、ME-专业医学搜索引擎 http:/ 是一种细胞膜糖蛋白和内皮细胞黏附分子，主要表达于正常的间质组织，包括平滑肌细胞、内皮细胞、肌纤维母细胞和雪旺细胞，造血细胞不表达，其功能主要是通过跨膜信号参与各种细胞过程，包括黏附、细胞骨架重组、形态改变、迁移与增殖5。CD29、CD44 和 CD106分别是整合素家族标记、透明质酸酶/纤维结合蛋白受体和血管细胞黏附分子-1，参与造血细胞与骨髓基质细胞的黏附、增殖和迁移，被作为基质细胞和间质细胞相对特异性的表面标志8。CD34 一直被认为是造血系的始祖细胞或干细胞的表面抗原标记，BMSCs 不表达 CD34。本研究分离培养的第 1 代 PDLCs 与 DP
6、Cs 相似，表达STRO-1、CD146、CD29、CD44 和 CD106，基本不表达 CD34，具有与 BMSCs 相似的表型特征9。研究证实分离培养的 PDLCs 和DPCs 中均存在一定数量早期未定向分化的干细胞。同时，STRO-1/CD106/CD146 均为血管周细胞表面抗原，提示 PDLCs 和 DPCs 中的干细胞定位于所在微环境的血管周围5，10。最近，有学者利用 STRO-1/CD106/CD146 筛选来源于牙周膜和牙髓中的间充质干细胞，发现 STRO-1 阳性或 CD106 阳性的PDLCs 和 DPCs 均具有高度增殖能力，低密度接种形成细胞克隆，表达 CD44、CD
7、166、核心结合因子 1、型胶原、骨涎蛋白和肌腱特有的转录因子 Scleraxis 等，植入免疫缺陷鼠体内分别形成牙骨质/牙周膜样结构和牙髓/牙本质复合体2，10。CD146 阳性的 DPCs不表达成牙本质特有的牙本质涎蛋白，属于未成熟的前成牙本质细KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PDLCs 的 STRO-1 阳性表达百分比高于Nagatomo 等1报道的结果（1.2%） ，较 DPCs 的 STRO-1 阳性表达低，但差异无统计学意义，表明 PDLCs 和 DPCs 中 STRO-1 阳性细胞数量相近。PDLCs 中 CD106 阳性表达百分比与 Kern 等11报道的 BMSCs
8、 中 CD106 阳性细胞结果相近。PDLCs 中 CD106 阳性表达百分比高于 DPCs，CD146 阳性表达百分比低于 DPCs，差异有统计学意义。这提示应用 CD106 或 CD146 对 PDLCs 或 DPCs 进行分选时具有不同优势，而 CD106 和 CD146 在 PDLCs 和 DPCs 的不同表达是否对于细胞功能具有重要作用尚需进一步研究。STRO-1 在未成熟细胞上有高水平的表达，当长期培养后大量其他分化抗原或细胞功能性标志物出现时，它们的水平明显下降12。将 STRO-1 和 CD146 同时用于筛选 BMSCs，发现 STRO-1/CD146 阳性的 BMSCs 的
9、 CFU-F 增加 2103 倍，没有检测到成骨标记核心结合因子 1 和骨钙素（osteocalcin，OCN） ，经体外扩增后表达核心结合因子 1 和 OCN，提示 STRO-1/CD146 可以作为BMSCs 分化早期的标记5。Banfi 等13认为随着 BMSCs 大量扩增，会发生复制性老化。这种老化现象是由于 BMSCs 在体外扩增时缺失端粒酶活性或者是端粒酶活性减少，端粒酶在细胞分裂期间对维持端粒长度和染色体稳定发挥重要作用，加强端粒酶活性可以明显增强 BMSCs 的增殖生命期和成骨潜能14。STRO-1 阳性/碱性磷酸KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PDLCs 经过 21
10、 d 培养后，克隆形成有效率自 60%下降至30%1。提示 STRO-1 是干细胞分化早期的标记物。本研究对STRO-1 和 CD146 阳性表达百分比进行多代追踪，发现 3 组不同来源 PDLCs 与 DPCs 的 STRO-1 或者 CD146 阳性细胞均随传代而逐渐减少，其中 STRO-1 阳性细胞减少较明显，推测 PDLCs 和 DPCs 在体外随着培养时间的延长，其中的干细胞可能发生自分化和老化，STRO-1 和 CD146 表达下降。本研究证实 PDLCs 和 DPCs 中存在一定数量的成体干细胞，干细胞成分随体外传代而减少。提示在利用 STRO-1/CD146 等表面标记分选生物
11、性状同源性的细胞亚群时应选择扩增培养早期代数的PDLCs 和 DPCs，以便获得理想的种子细胞数目。【参考文献】1 Nagatomo K, Komaki M, Sekiya I, et al. Stem cell properties ofhuman periodontal ligament cellsJ. J Periodontal Res, 2006, 41（4）：303-310.2 Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotentpostnatal stem cells from human periodon
12、tal ligamentJ. Lancet,2004, 364（9429）：149-155.3 Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dentalpulp stem cells（DPSCs） in vitro and in vivoJ. Proc Natl AcadSci USA, 2000, 97（25）：13625-13630.4 Simmons PJ, Torok-Storb B. Identification of stromal cell KKME-专业医学搜索引擎 http:/ in human bone m
13、arrow by a novel monoclonal antibody,STRO-1J. Blood, 1991, 78（1）：55-62.5 Shi S, Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymalstem cells in human bone marrow and dental pulpJ. J BoneMiner Res, 2003, 18（4）：696-704.6 Yang X, Zhang W, van den Dolder J, et al. Multilineage poten-tial of STRO-1+
14、 rat dental pulp cells in vitroJ. J Tissue EngRegen Med, 2007, 1（2）：128-135.7 Yang X, van den Dolder J, Walboomers XF, et al. The odonto-genic potential of STRO-1 sorted rat dental pulp stem cells invitroJ. J Tissue Eng Regen Med, 2007, 1（1）：66-73.8 Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al. Adult stem
15、 cells frombone marrow（MSCs） isolated from different strains of inbredmice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differen-tiation potentialJ. Blood, 2004, 103（5）：1662-1668.9 Yamada Y, Fujimoto A, Ito A, et al. Cluster analysis and geneexpression profiles： A cDNA microarray system-based comparisonbetween human dental pulp stem cells（hDPSCs） and human me-senchymal stem cells（hMSCs） for tissue engineering cell therapyJ. Biomaterials, 2006, 27（
