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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ tk 表型缺陷型(tk-)细胞株作为宿主细胞。由于选择 tk+细胞的培养含有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做 HAT 选择法。其选择原理为：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(A)处理细胞，二氢叶酸还原酶被抑制，不能使二氢叶酸还原成四氢叶酸，其结果是培养基中的四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从 dUMP 合成 TTP 以及 dATP 和 dCTP 的合成过程均被阻断。次黄嘌呤是 dATP 和 dCTP 补救合成途径的一种底物，培养基中含有这种物质时，细胞就能越过氨基蝶呤的抑制作用
2、，利用补救途径继续合成出这些核苷酸。同时由于在 HAT 培养基中含有外源的胸苷(T)，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ tk-细胞通过胸苷激酶的作用合成 TTP，继续存活下去;而 tk-细胞因缺乏胸苷激酶而不发生这种合成，因而死亡。如将正常的 tk 基因导入 tk-细胞，这些细胞能够存活下去。所以使用 HAT 培养基，能够选择出经 tk 基因转化的 tk-细胞。二、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)在真核细胞的核苷酸合成中起着重要的作用，它催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，四氢叶酸在胸腺嘧啶的合成过程中提供甲基，无四
3、氢叶酸则不能合成胸腺嘧啶。由二氢叶酸还原成四氢叶酸的反应过程能被叶酸的类似物氨基蝶呤和氨甲蝶呤竞争性抑制。dhfr-表型的细胞由于不能合成四氢叶酸，除非培养基中含有外源的胸腺嘧啶、甘氨酸和嘌呤，否则细胞就会因胸腺嘧啶及嘌呤的饥饿而死亡。但将 dhfr 基因转入缺陷型细胞后，细胞则能合成四氢叶酸，进而使细胞的核酸合成能够进行，所以转入 dhfr 基因的细胞就能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中存活，而未转入 dhfr 基因的细胞则被选择淘汰。dhfr 基因选择系统需要 dhfr-表型的受体细胞，这就限制了它的使用范围。但这一选择系统有一个明显的优点，就是它可以使外源基因得到扩增，当培养基中逐渐
4、增加氨甲喋呤(methotrexate，MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX 抗性的增加，dhfr 基因与外源基因均明显扩增，进而使外源基因的表达产物增加。三、新霉素抗性选择系统新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋KKME-专业医学搜索引擎 http:/ G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达，当 neo 基因与能有效转录的真核 DNA 序列连锁时就能获得有效的表达。neo 基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使 G418 失活。所以，当细胞表达了这种 neo 抗性基因后，就会在含 G418 的选择培养基中存活
5、，这种选择系统适用于所有的细胞类型。四、氯霉素乙酰转移酶基因选择系统氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase，cat)是由大肠杆菌转座子 Tn9 编码的，cat 可催化氯霉素发生乙酰化作用，从而使其失去活性。虽然真核细胞不含有内源的 cat 酶活性，但真核细胞的启动子却可引发外源 cat 基因的表达，所以细菌的这个基因可以作为检测外源基因导入真核细胞的一种十分敏感的标记基因，尤其是这一选择系统适用于瞬时表达的研究。带有 cat 基因的质粒载体转化到哺乳动物细胞后。就会合成 cat。哺乳动物细胞本身不能合成 cat，所以只要在转化的细胞中检测到 cat 的活性，即可肯定它是来自外源的 cat 质粒，这也是 cat 基因选择系统的一大优点。为了测定转化细胞的 cat 的活性，在转化后的 4872 小时，离心收集细胞，并制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶 A 和 14C 标记的氯霉素进行孵育，如果细胞中有 cat 存在，氯霉素就被乙酰化，作薄层层析分离。便可将氯霉素和乙酰化的氯霉素分开。然后通过放射自显影技术测定乙酰化的产物。此法十分灵敏，而且精确。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ http:/
