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1、兔抗原诱导性膝关节炎滑膜巨噬细胞M R 成像的初步研究合肥，安徽医科大学第一附属医院放射科( 2 3 0 0 2 2 ) 施万印余永强张诚吴津民安徽医科大学药理学研究所沈玉先滑膜巨噬细胞在类风湿性关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，R A ) 发生发展的过程中起着极其重要的作用，能否用M R I 监测巨噬细胞在滑膜的浸润，并进而为药物干预提供直观的工 具。据笔者检索国内未见这方面的研究，通过建立兔膝抗原诱导性关节炎( a n t i g e n i n d u c e da r t h r i t i s A A ) ，初步探讨超微超顺磁性氧化
2、铁粒子( U S P I O ) 标记滑膜巨噬细胞，进而行M R 成像的可行性。 材料与方法1 实验动物：1 2 只雌性大耳白兔，体重2 0 3 0k g ，购自安徽医科大学实验动物中心。 2 模型制作：随机选取9 只大耳白兔，统一选取右膝关节制成A A 模型。自兔耳缘静脉注入3 戊巴比妥( 1m l k g 体重) ，透视引导下穿刺右膝关节腔，注入0 5m l 甲基化小牛血清蛋白( m e t h y l a t e db o v i n es e r u ma l b u m i n ，m B S A ，购自s i g m a 公司) ( 2m g m lm B S A ，溶 于5 生理盐
3、水) ，诱导A A 模型。左膝关节穿刺后仅注入等量生理盐水。诱导前1 4 天及2 8天，以相同抗原皮内多点注射0 5m l 致敏。剩余3 只致敏后制成假模型组：右膝关节穿刺仅注入0 5m l 生理盐水，左膝不做任何处理。将大白兔饲养于标准化条件下，可以自由饮食水。 观察膝关节肿胀程度，动物体重增减和行走情况。3 躲扫描方案：所有动物致模前均行双膝关节M R 扫描，便于致模前后对比。致模后9 2 8 天( 平均2 1 3 天) ，于U S P I O ( S i n e r e m 9 ，购自法国G u e r b e t 公司) 注射前、注射后2 4h 各行一次M R I 扫描；其中2 只兔还
4、于U S P I O 注射后4 8h 、7 2h 各行1 次M R I 扫描；3 只假模型组动物于U S P I O 注射前、注射后2 4h 各行1 次M R I 扫描，扫描包括双膝关节。扫描序列包括：T 1 W I 、F S ET 2 W I 、T 2 * G E 、F L A I R 以及S T I R 序列。具体参数如下：T 1 W I ：T R3 0 0m s ，T E1 4m s ；F S ET 2 W I ：T R3 2 5 0 3 0 0 0m s ，T E1 0 2m s ，回波链长度( E T L ) 2 0 一2 4 ；S T I R ：T R5 0 0 0m s ，T E
5、3 4I l l S ，I R1 5 0m s ，E T L2 4 ；T 2 G R ：T R4 0 0m s ，T E1 5m s ，翻转角( f l i pa n g l e ) 2 0 ；F L A I R ：T R8 0 0 0m s ，T E1 4 0m s ，I R1 9 0 0m s 。N E Xl 一5 ；矩阵( M a t r i x ) 1 9 2 1 6 0 2 5 6x1 9 2 ；F O V ：8 8 9 9 ；层厚( t h i c k n e s s ) ：3 0 m m ；层间距为零。常规扫描横断面、矢状面和冠状面。采用G E1 5TH o r i z o nM
6、 R I 扫描仪，3i n 表面线圈；U S P I O 用量为0 3m l k g体重。4 组织病理学检查：最后一次扫描后立即处死动物，完整暴露右膝关节囊，结合M R I 的信号改变，分别从关节囊的不同部位分离取下关节囊组织，并固定于4 福尔马林液中。对侧关节囊以相同方法取材、固定，并石蜡包埋。普鲁士蓝初染，核固红复染胞浆胞核，于不 同倍数下观察铁的分布；苏木素一伊红染色( H E 染色) ，观察巨噬细胞的数量和分布。5 M R 图像分析和统计学处理：所有影像资料均传至工作站，由2 位副主任医师在不知 道实验背景的情况下共同阅片，取得一致意见。将关节囊和关节腔内液体量分为生理量、少量、中量和
7、大量积液。测量病变滑膜的厚度。采用感兴趣区法，分别测量不同序列( T t w I 、F S ET 2 W I 、T 2 + G E ) 上U S P I O 增强前、增强2 4 h 后病变滑膜信号强度( s i g n a li n t e n s i t y ，S I ) o计算滑膜信噪比( s i g n a ln o i s er a t i o ，S N R ) 。然后计算变化S N R ( AS N R ) ：AS N R = 【( S N R 即。一S N R p 。) s N 鼯。】Xi 0 0 ，S N R , 。为U S P I O 增强前滑膜S N R ，S N R p ，
8、。为U S P I O 增强后滑膜S N R 。 所有数据以膏S 表示。将增厚滑膜增强前信号强度与增强后信号强度行配对t 检验。统计分析由S p s sI I 5f o rw i n d o w s 完成。P 0 0 5 被认为有统计学差异。结果】I 一般情况：实验过程中无动物死亡，注射U S P I O 后可见一过性喷嚏，无须处理。9 只新西兰大白兔右膝关节均成功诱导A A 模型，左膝关节与假模型组双膝均未诱发关节炎。致模 后2 4h 后即可观察到右膝关节肿胀，于4 7 天左右最明显，随后肿胀减轻，但仍较对侧为肿。局部无化脓、破溃、感染。可观察到跛行现象。体重下降不明显。2 M R I 表现
9、：模型组9 只兔右膝关节滑膜均增厚，2 0 7 0 9 7m ( 范围1 3 3 3 5 0I n r n ) ；呈等或稍长T - 信号，F S E W I 、T ：+ G E 、S T I R 以及F L A I R 序列呈中等高信号。右膝髌上囊、髌下囊以及关节腔均可见不同程度积液，3 例为大量积液，5 例为中等量积液，1 例为少量，呈长T - 信号，F S ET 2 W I 、S T I R 序列为明显高信号，T ：4G E 为中等高信号，F L A I R 信号明显下降。左膝关节及3 只假模型组双膝关节滑膜未见明显增厚，直径均不足1m m ；关节囊及关节腔可见生理量液体信号。 3 U S
10、 P I O 增强后M R I 表现：注射U S P I O2 4 h 后，序列上可见T ，信号上升( S N - R 为4 1 9 1 2 7 9 4 ，t = 一3 1 0 7 ，P = 0 0 3 6 ) ；F S ET 2 W I 、T 2 G E 序列均可见滑膜信号下降，S N R分另U 为3 4 9 2 1 1 7 7 ( t = 4 5 5 5 ，P = 0 0 1 ) 、5 7 2 4 1 6 0 5 ( t = 4 1 3 5 ，P = 0 0 1 4 ) 。以T 2 +G E 序列上滑膜信号变化最明显。注射U S P I O4 8h 后，各序列信号开始恢复。7 2h ，信号
11、基本同增强前。4 病理：H E 染色可见模型组9 例右膝关节滑膜不同程度增厚，多量血管翳形成，衬里层和衬里下层可见大量炎症细胞，高倍镜下见主要为滑膜巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。 普鲁士蓝染色可见滑膜衬里层大量铁粒子沉积，核固红复染见主要位于巨噬细胞胞浆。左膝关节以及3 只假模型组双膝关节滑膜未见炎症改变，未见明显铁粒子沉积。 讨论1 R A 影像学研究现状：R A 是一种侵犯关节滑膜，进而破坏关节软骨和骨质，严重影响患者劳动力的疾病。病因不明，认为是一种自身免疫性疾病。国内R A 的影像学研究主要集中于X 线、C T ，且主要以人为研究对象，回顾性研究居多。熊壮等利用X 线位相对比成像，比
12、传统X 线更早发现大鼠佐剂性关节炎所致细微骨质改变，包括骨质疏松、骨质破坏和骨膜反应比。但上述研究都难以揭示R A 的早期病变一滑膜炎。近来M R I 的研究报道渐多瞄一73 。M R I 软组织分辨力高，成像方式灵活，在早期诊断方面优势独特，且比X 线、c T 发现更早、更多的骨质破坏，是唯一能显示软骨病变的影像手段。更有意义的是，借助特异性分子对比剂，M R I 可以从细胞分子水平显示滑膜炎症。，从而为R A 的分子影像学研究提供新的思路。本研究中，早在致模后9 天，M R I 就可追踪到滑膜巨噬细胞的活动，提示本研究具有巨大的潜在应用价值。相比国外，国内关于R A M R 成像方面的动物
13、实验罕见。目前应用较广泛且较成熟的整体动 物实验模型有胶原诱导性关节炎、佐剂性关节炎、多聚糖蛋白诱导的关节炎以及佐剂角叉菜胶诱导的关节炎等。选择的动物一般为啮齿类和灵长类。一般认为，佐剂性关节炎大鼠和胶原诱导性关节炎小鼠是研究R A 、筛选抗炎免疫药物的较理想模型伸3 。大鼠和小鼠肢体细小， 对M R I 硬件要求高，限制了其在M R I 研究中的应用。本文选用大耳白兔，参考D a w s o n 等H 介绍的方法，以m B S A 诱导膝关节R A 模型获得成功，且对M R I 硬件要求不高，值得推广。因为是诱导单侧膝关节炎症，可以自身对比，是这种模型的独特优势。常规M R I 并不能比X
14、线、c T 从更深的层次揭示R A 的细胞和分子学机制。纳米级粒子对比剂的开发应用为我们从微观领域进行M R 成像提供了可能。U S P I O 是一种新型的M R 纳米对 比剂。与一般S P I O 都属于网状内皮系统对比剂，均以磁化率效应为主要增强机制，但两者间存在许多不同之处，与S P I O 粒子相比，U S P I O 粒子体积更小，血浆半衰期更长，除在肝脾中聚集外，被淋巴结和骨髓摄取量多，可以被组织细胞吞噬，具有较明显缩短T ，、T 2 弛豫时间的效应；U S P I O 的T - 弛豫率在1 5 2 5 s 1 m M - 1 左右，而S P I O 粒子缩短T - 的作用相对较
15、弱。因此U S P I O 更适于巨噬细胞成像”。2 兔膝关节A A 模型滑膜巨噬细胞腿成像：滑膜衬里细胞主要有两种：巨噬样A 型滑膜细胞和成纤维细胞样B 型滑膜细胞，并且A 、B 型细胞的形态及功能可以相互转化。正常滑膜衬里层细胞以A 型巨噬样滑膜细胞为主，主要来源于血液中单核细胞的浸润转移，局部增生不明显。通常认为，R A 滑膜A 型巨噬样滑膜细胞来源于血液中单核细胞的浸润转移。也有研究表明，R A 滑膜聚集增多的巨噬细胞还与巨噬细胞在局部增生有关u ”。R A 早期的病理改变是滑膜炎，进而造成软骨和骨的侵蚀性改变。巨噬细胞在R A 滑膜炎及关节破坏中扮演枢纽作用，大量存在于炎症滑膜以及软
16、骨血管翳连接处u “。它们活化后，会过度表达主要组织相容性复合物类分子，促炎或调节细胞因子和生长因子( 如I L 一1 ，I L 一6 ，I L i 0 ，I L 一1 3 ，I L 一1 5 ，I L 一1 8 ，T N F d 和G M C S F ) ，化学因子和化学趋化因子( 如I L 一8 ，巨噬细胞炎症蛋白M I P 一1 ，单核细胞趋化蛋白M C P 一1 ，金属蛋白酶和新喋呤等。戴冽等观察到u2 。：A A 大鼠滑膜巨噬细胞包括衬里层巨噬样A 型滑膜细胞和衬里下层浸润的巨噬细胞均明显增多；衬里层巨噬样A 型滑膜细胞和衬里下层浸润的巨噬细胞可能在关节破坏中起作用，且与放射学指数( r a d i o g r a p hi n d e x ，R I ) 存在相关性。本研究为活体研究炎症细胞的变化规律提供了直观工具。有研究显示，关节炎诱导1 7d左右，滑膜中浸润的炎症细胞超过2 8 属于单核细胞系统
