《抗人乳头瘤病毒体外药效模型的探讨——人乳头瘤病毒转染或感染HaCaT细胞株的初探》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗人乳头瘤病毒体外药效模型的探讨——人乳头瘤病毒转染或感染HaCaT细胞株的初探（106页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学博士学位论文抗人乳头瘤病毒体外药效模型的探讨人乳头瘤病毒转染或 感染HaCaT细胞株的初探姓名：吴剑波申请学位级别：博士专业：皮肤病与性病学指导教师：郑家润20050901! ! 塑塑堕型查堂堕主堂垡丝壅AA PA P E SB C H l ，N B Tb pB S AC P ED A BD E P CD I GD M 呕ME BE D T AF Q P C R玎E P E SH P Vn r NL C Rm I Mm Mm l缩略语a b s o r b a l l c e ，吸光度a l l ( a J j n ep h o s p h a t a s e ，碱性磷酸酶3
2、一a m i n o p r o p y l t r i e m o x y s i l a m e ，3 一氨基丙基三氧硅烷5 - b r o m o 4 。c h l o r o 。3 - i n d o l y l 巾h o s p h a t e n i t r o b l u et e t r a z o l i u m ，5 一澳一4 。氧3 一哼哚- 磷酸盐硝基蓝四唑盐b a s e p a i r ，碱基对b o V i n es e m ma l b 啪i n ，牛血清白蛋白c y t 叩a m i ce 虢c t ，细胞病变效应d i 锄i 1 1 0 b e n Z i
3、d j n e ，二氨基联苯胺d i e t h y Ip ”o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯d i g o x i g e n i n ，地商辛D u 】b e c c o sM o d i 丘c a t i o no f E a g l e sM e d i u m ，角质形成细胞改良培养基e t l l i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c8 c 斌乙二胺四乙酸二钠n u o r e s c e mq u a n t i t a t j V ep
4、 0 1 ) 恤e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，荧光定量多聚酶链反应4 ( 2 。h y d r o x y e t h y I ) - 1 - p j p e r a z i n e e t b a n e s u i f o I l i ca c i d ，N 一2 羟乙基哌嗪N 2 乙磺酸h u m a np 印i l l o m a v i m s ，人乳头瘤病毒i n t e f 硒I D n ，干扰素l o n gc o m r o lr c g i o n ，长控制区m i n m e ，分( 钟)m 0 1 ，J ，摩尔升m m o I l
5、 ，毫摩尔升m i l l i l i t e r 毫升I I P V 转染或感染 a c a T 绌胞的初探m R N AM Wo D( ) R FP B SP C RP R l N Sp R bR N a s eR T P C Rr p mSS A B CS D SS S CU R Rm e s s a g e rR N A ，信使R N Am o l e c u l a rw e i g h t ，分子量o p t i c a ld e n s i t y ，光密度o p e nr e a d i n g 抒a m e 开放阅读框架p h o s p h a t eb u 髓rs o j
6、 u t j o n ，磷酸盐缓冲液p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应p 血n e di ns i t ul a b e l j n g ，引物介导的原位标记r e t i n o b l a s t o m ap m t e i n ，视网膜母细胞瘤蛋白r j b o n u c l e a s e ，核糖核酸酶r e v e r S et r a n s c r i p t a s eP C R ，逆转录酶P c Rr e v o l u t i o n sp e rm j n u t e ，转分s e c o n d
7、。秒s 订e p a v i d i n - b i o t i n p e r o x i d a t e ，链霉亲合素生物素过氧化物酶复合物s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e ，十二烷基磺酸钠s t a n d a r ds o d i u mc i t r a t e ，柠檬酸钠缓冲液u p s t r e a n lr e g u l a t o r yr e g i o n ，上游调节区中国协和医科人学博士学位论文全文摘要人乳头瘤病毒( H P V ) 可引起人类多种良恶性疾患。H P V l 6 、1 8 等高危型由于和宫颈癌等多种恶性
8、肿瘤关系密切，研究较为深入；H P v 6 、1 】等低危型是引起尖锐湿疣与呼吸道乳头瘤病的主要病原，随着发病率的增加近年来也日益受到重视。H P V 由于生活周期对上皮分化严格依赖，不能在常规的细胞培养体系中传代扩增，长期以来阻碍着人们对其研究的深入；而近年来组织培养与分了生物学技术的进步则为H P V 的细胞模型研究注入了新的内容与可能性。本研究选择低危型H P V 6 、1 1 为研究对象，以人永生化角质形成细胞H a c a T 作为宿主细胞，通过转染及感染方式获取携带有H P V D N A 的阳性细胞，并对相关感染标志进行检测，旨在在H P V 体外研究领域进行初步尝试，为下一步H
9、 P v 体外药效评价模型的建立及药物抗H P V 活性的检测打下基础。全文具体分为两部分。第一部分I m v l l 基因组D N A 对H a c a T 细胞的转染与检测目的探讨应用转染与筛选技术获取稳定携带有H P V l l 基因组D N A 的细胞的可能性；探索合适的H P V 感染检测指标与方法。方法对含有p B R 3 2 2 H P V l l 质粒的大肠杆菌培养扩增，然后进行质粒的提取与纯化，并用限制性内切酶B a m H I 切割下H P v l l 全长基因；低熔点琼脂糖剧收后，用T 4D N A 连接酶进行线状D N A 的自身环化，再与P T K n e o 质粒按
10、比例混合，以L i p o f e c t a m i n e 试剂共转染H a C a T 细胞；最后通过G 4 1 8 筛选而得到阳性细胞克隆。将阳性克隆细胞合并与培养扩增后，用F Q P c R 及P R I N s 技术检测所得细胞内H P v l l D N A 的存在，用巢式R T P c R 技术检测H P v l lE 1 “4 m R N A的表达，用免疫组化技术检测H P v 衣壳抗原的表达。结果G 4 1 8 筛选约两周后，培养皿内即可见到对G 4 1 8 抵抗的阳性细胞克隆出现，其形态与普通H a C a T 细胞无区别。F Q P c R 与P R I N S 方法均
11、可在筛选后的H a C a T 细胞中检测到H P v l lD 】q A 的存在。R T P c R 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳可检测到特异性的6 2 8 b p 阳性条带。免疫组化染色未检测到H P v 衣壳抗原表达。结论H P V l l 基因组D N A 可通过脂质体转染法成功导入H a c a T 驽H 胞内，通H P v 转染或感染H a c a T 细胞的初探过筛选可以顿得稳定性及阳性率较高的阳性细胞。H P V l l 的D N A 与m R N A 均可作为感染标志并可通过多种方法检测；但在单层培养中H P V 衣壳抗原不表达，不宜作为检测指标。第二部分H P v 6 ，1 l
12、 型病毒颗粒对H a c a T 细胞的感染与检测目的探讨H P V 6 1 l 型病毒颗粒体外感染H a C a T 细胞的可能性及感染条件；并对相关感染指标进行检测。方法从临床尖锐湿疣标本中分离提取H P v 病毒颗粒，通过型特异性P c R 明确为H P V 6 1 l ；再以之实验性感染单层培养的H a C a T 细胞。以F Q P c R 技术临测病毒悬液与感染后H a C a T 细胞的病毒D N A 载量；用P R J N S 方法原位检测感染后H a c a T 细胞中H P VD N A 的存在及分布；以免疫组化法检测H P V 的衣壳抗原表达。结果在本研究所采取的感染条件
13、下，当病毒悬液中H P vD N A 达到1 0 5 拷贝m 1 以f = 时，病毒处理后的H a C a T 细胞F Q P c R 检测结果呈稳定阳性；P R I N S方法可检测到胞核阳性染色的细胞存在；免疫组化法未能检测到H P v 衣壳蛋白的表达。结论临床尖锐湿疣组织中提取的H P V 6 1 1 病毒颗粒可以在实验条件下感染H a c a T 细胞，但对病毒浓度及具体感染条件有一定要求。在感染细胞核内町检测到H P vD N A 存在，但无衣壳蛋白表达。4中周协和医科大学博士学位论文A B S T R A C TH u m a np a p i l l o m a “r u s e
14、 s ( H P V s ) a r es m a l l ，d o u b l e s t r a n d e dD N AV i r u s e st 1 1 a ti n l 色c tm u c o s a la 1 1 dc u t a n e o u se p i t h e l i a ，a 1 1 dc a u s eb e n i g no fm “i g n a n tn e o p l a s t i cl e s i o n s M o r et h a n1O OH P Vg e n o t y p e sh a V eb e e ni d e n t i 行e da
15、n do n e t h i r do ft h e l l li n f e c ta n o g e n i t a lr e g i o n ，w h i c hc a nb ed i V i d e di n t oh i 曲一r i s ka 1 1 d1 0 w - r i s kt y p e sd e p e n d i n go nt h e i ra s s o c i a t i o nw i t hm a l i g n a n c y fT h eh j 曲一r i s kH P V s ，s u c ha sH P V l 6a n dH P V - 18 ，a r
16、 et l l ee t i o l o g i c a la g e n t so fc e r v i c a lc a l l c e ra n dh a v eb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d T h e1 0 w r i s kH P V s ，s u c ha sH P V 一6a n dH P V 一11 ，a r eg e n e r a l l ya s s o c i a t e dw 曲a n o g e I l i t a la n dl a r y n g e a lw a n s ，a 1 1 da l s oi m p o r t a n tt y p e sd u et ot h e i ri n c r e a s i n gi n c i d e n c e s T h el i f ec y c l eo fH P V si ss t r i c t l yd e p e n d
