《X射线能谱EDS分析方法及其在电镜酶细胞化学中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《X射线能谱EDS分析方法及其在电镜酶细胞化学中的应用（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、x 射线能谱( E D S ) 分析方法 及其在电镜酶细胞化学中的应用梁社坚1 伦璇2 吴鸿( 1 华南农业大学药用植物研究中心；2 华南农业大学测试中心，广东广州5 1 0 6 4 2 )x 射线能量色散谱分析方法( e n e r g yd i s p e r s i v eX - m ys p e c t r o s c o p y ，E D S ) 通常称为x 射线能谱分析方法，是分析电子显微镜的基本方法。x 射线能谱分柝方法具有成份分析功能和高分辨率的特点，在电予显微学、材料科学、生物医学、地质等领域得N T 广泛的应用口“1 。电镜酶细胞化学( e l e c t r o n m
2、i c r o s e n p i cc y t o c h e m i s t r y o f e n z y m e ) 是运用电子显微镜超薄切片技术研究酶细胞化学的一门崭新技术，其任务是研究细胞中各种酶在超微结构水平上的分布及其在细胞生理和病理过程中的变化，以及这些变化与细胞功能的关系口1 。X 射线能谱分析方法和电镜酶细胞化学把“超微观察和超微分析”密切结合起来，为人们在超微结构水平进行研究提供了可靠的分析手段。1x 射线能谱分析的原理特征x 射线的产生是入射电子使内壳层电子激发而发生的现象。对于试样产生的特征x 射线，有两种展成谱的方法：x 射线能量色散谱方法( E D S ) 和射
3、线波长色散谱方法( w a v e l e n g t hd i s p e r s i v eX m ys p e c t r o s c o p y ，W D S ) 1 1o 在分析电子显微镜中均采用探测效率高的E D S 。从试样产生的x 射线通过测角台进入到探测器中，其探测器一般都是用高纯单晶体中掺杂有微量锂的半导体固体探测器( s o l i ds t a t ed e t e c t o r ，S S D ) 。S S D 是一种固体电离室，当x 射线入射时，室中就产生与这个X 射线能量成正比例的电荷1 1J 。而这个电荷在场效应管( f i e l de f f e c t t
4、 r a a s i s t o r ，F E T ) 中聚集，产生一个波峰值比例于电荷量的脉冲电压。用多道脉冲高度分析器( m u l t i c h a n n e lp u l s e h e i g h ta n a l y z e r ，M P H A ) 来测量它的波峰值和脉冲数。这样，就可以得到横轴为x 射线能量，纵轴为x 射线光子数的谱图。根据它的能量值就可以确定元素的种类，而且通过谱的强度分析就可以确定其含量。为了使硅中的锂稳定和降低F E r 的热噪声，平时和测量时都必须用液氮冷却E D S 探测器。最近，正在开发不需要用液氮冷却的E D S 探测器【6 J 。2x 射线能
5、谱分析在电镜酶细胞化学中的应用屯镜酶细胞化学与光学显微镜组织化学明显不同，后者是让酶与染色剂作用形成一种有颜色的反应产物，通过观察产物的颜色效果来确定它在细胞中的分布。而前者只有当它在细胞中形成一种不溶性的、又不易从形成的位置上被除去的、电子密度很高的反应产物后，才能在电子显微镜下被检查出来口J ，而这些反应产物通常为重金属沉淀。x 射线能谱分析通过对这些沉淀物的微区进行定性及定量分析，为判断是否为该金属沉淀提供了直接而可靠的依据。以果胶酶在广佛手果皮中分泌囊细胞中的定位为例，介绍x 射线能谱分析在电镜酶细胞化学中的应用和实验方法。2 1 材料与方法参照A l l e na n dN e s
6、s l e r I “的方法，选取新鲜材料，分割成小于l n u n 3 的小块，迅速投入K a r n o v s k y 固定液( 3 多聚甲醛+ 2 戊二醛，0 0 5 m o l L 磷酸缓冲液配制，p H 7 2 ) 中，在0 4固定2 4 h ，然质磷酸缓冲液洗涤，晟后磷酸缓冲液0 “ C 过夜。样品用0 。5 果胶( O 1m o l L 乙基金项目：国家自然科学基金资助项目( N o3 0 2 7 0 0 8 3 ) 及广东省科技攻关资助项( N o C 2 0 6 0 5 )2 6酸钠缓冲液配制p H 5 O ) 室温处理2 0 r a i n 后，立即投入B e n c d
7、 i c t s 液在8 0 9 0 。C 孵育1 0 m i n 。对照1 用乙酸缓冲液拳温处理2 0 m i n ，冉在B e n e d i c t s 液8 0 9 0 。C 孵育1 0 m i n 。对照2 先r EB e n e d i c t s液8 0 9 0 。C 孵育l O m i n ，再在果胶中室温处理2 0 m i n 。对照3 在果胶室温处理2 0 m i n 后，再_ f = | 磷酸缓冲液8 0 一9 04 C 孵育1 0 m i n 。所有处理冷却后用一甲砷酸钠缓冲液( 0 0 5 m o l L ，D H 72 ) 洗涤然后用1 锇酸( O0 5 m o F
8、 L 。甲砷酸钠缓冲液配制，p H 72 ) 室温同定2 h 。蒸馏水冲洗f | 舌，系列酒精脱水，环氧丙烷过渡，E p o n 8 1 2 包埋。L e c i a U C T 超薄切片机切片，切片厚7 0 9 0 r i m 。镍网载片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，P h i l i pF E I - T E C H N A I12 电子显微镜观察及I N C A - A n a l y z e rX 射线能谱测试，其工作条件：加速电压2 0 k V ，电了束流l 1 0 1 0 A 。2 2 结果与讨论植物细胞壁的中层主要是由果胶多糖构成，它起到粘连相邻细胞的作用。另外在初生壁中也有果胶分布。
9、果胶主要是由多聚、F 乳糖醛酸亚单位通过a 一1 ，4 糖苷键连接而成的直链分子】。果胶酶能在任意位置打断果胶a 一1 , 4 糖营键，使果胶降解成还原性糖，并与B e n e d i c t s 溶液中的铺离子发生还原反应，生成氧化亚铜沉淀J 。这些沉淀出现的部位也代表者果胶酶的存在位置。在电子显微镜F ，相邻细胞的细胞壁角隅处出现密度夫的结晶状沉淀，此沉淀主要分布在相邻细胞壁的中层位置。此外，还有一些电子密度大的小颗粒散布在细胞壁上和细胞膜附近。为了验证此类沉淀物质是否为C u 沉淀，在这些沉淀密集的微区( 图1 ) 进行x 射线能谱分析，从能谱图( 图3 A ) O 可以观察到2 个N
10、i 元素的峰( K 。= 7 。4 8 k e V ，K e = 8 2 6 k e y ) 和两个C u 元素的峰瞰。= 8 0 5k e y ，K B = 8 9 0 k e Y ) ，其中，c u 的K 。峰与N i 的K - 峰十分接近而相互重叠。而对照中( 图2 ) ，相邻细 胞壁中基本无电子密度大的小颗粒分布，在此处的能谱图( 图3 B ) 中也可看4 个峰，但C u 的k 、K 。峰和N i 的K - 峰很低，略高于本底。从定量分析结果( 表1 ) 看出，沉淀物中的C u 的谱峰面积比N i 的高，所以重量百分比也高，达6 2 7 9 。而对照中虽然也有C u 峰，但谱峰面积远远
11、低于N i 的谱峰面积，重量百分比只占2 5 4 1 。因为对照的试样经过B e n e d i c t s 液处理或者铜质的试样架也可能发生散射，故含有C u 峰。从以上的定性和定量分析的结果可I 三I 证明此沉淀确为C u 沉淀。表lE D S 定量分析结果T a b l eIR e s u l t so f t h eE D Sq u a n t i t a t i v ea n a l y f i s3 结论X 射线能谱分析具有高速度、高容量、高稳定性等特点，可以运行复杂的智能定性定量分析程序，此外还具各相当完备的对电子显微镜图象和X 射线图象进行处理和分析的能力”1 。自7 0年代开
12、始至今的3 0 年中，X 射线能谱分析异军突起，一跃成为微区分析的主要方法手段。随着电镜酶细胞化学技术的介入，两者结合的日益完善，必将在生物医学领域尤其在蛋白质在细胞中的定位、超微结构水平等方面的研究中发挥更大的作用。参考文献略蚓1 果胶酶的反应产物出现在相邻细胞角隅处、中层和细胞壁中( 箭头) 。( B a i , = 8 0 0 n m )图2 果胶酶的反应产物没有出现在相邻细胞角隅处、中层和细胞壁中。( B a r = 8 0 0 n m )C u能量E n e r g y ( k e Y )图3 不同微区的X 射线能谱图；A 果胶酶反应产物密集的微区；B 没有果胶酶反应产物的微区。一富csc石I童。邑越嘎捉罂
