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1、人与小鼠m y o s t a t i ns i R N A 载体的构建及突变型m y o s t a t i np r o p e p t i d e 的重组表达黄庆生薛小平+ 阎岩商澎骞爱荣贾斌傅增祥尹大西北工业大学生命科学院，西安7 1 0 0 7 2 ，骨丢失和骨髂肌肌肉群( 量) 丢失是太空飞行中，机体长期处于失重状态下出现的慢性不良反应。在骨骼肌丢失中，m y o s t a t i n ( M Y S ，肌肉生长抑制索) 起着重要的作用。M Y S 属T G F B 超家族成员，在骨髂肌的生长中起着关键的负调控作用。正常状态下M Y S 表达维持在一定的水平，使肌肉生长处在一个平
2、衡状态。该基因缺失或敲除的动物，全身骨骼肌超常发达，肌肉增加2 3 倍。而在肌肉萎缩的人体内，该基因的表达水平则显著升高。在航天生命科学领域，M Y S 的研究也受到了关注。实验表明历经1 7 天太空旅行后的大自鼠，其体内的M Y S 水平明显提高，预示着骨骼肌丢失的前兆( L a l a n i 等) 。M Y S 全长3 7 6 个氨基酸，由骨骼肌细胞表达后，在第2 6 7 位氨基酸处被蛋白酶裂解成两个片段，N 端部分称p r o p e p t i d e ，C 端片段为M Y S 的活性区域，两个C 端分子通过二硫键形成一个二聚体并与p r o p e p t i d e 片段以非共价
3、的形式结合，C 端结合p r o p e p f i d e 后不表现出生物学活性。当结合在c 片段上的p r o p e p t i d e 被金属蛋白酶在第7 6 位的天门冬氨酸处裂解后，c 端就表现出其生物学活性。将该位置的天门冬氨酸突变为丙氨酸后，结合在c端上的p r o p e p t i d e 就不能被裂解，使c 端处于无活性状态( W o l f m a n 等) 。近年来，国内外众多实验证明：抑制体内M Y S 的水平，可促进成肌细胞的分裂和繁殖，这在人类健康( 如治疗肌肉萎缩症) 和农牧业上( 如培育多肌肉的牲畜) 有着重要的意义。所以如何有效抑制体内M Y S 已成为人们
4、研究的热点。克隆并表达M Y S 基因是开展本研究的基础，我们采用R T - P C R 方法从小鼠和人的骨骼肌细胞中分别克隆了M Y Sc D N A 基因，并在酵母菌中获得了表达。随后又对人以及小鼠p r o p e p t i d e 的第7 6 位的氨基酸进行突变，将原来的天门冬氨酸突变为丙氨酸，并将鼠与人突变型的p r o p e p t i d e ( 2 6 7 个氨基酸) 分别在酵母中进行表达。在此工作基础上，从两个方面着手对M Y S 进行研究，一是采用s m a l li n t e r f e r i n gR N A ( s i R A N A ) 的方法减少M Y S
5、 的表达，另一个就是采用第7 6 位氨基酸突变的方法，抑制M Y S 的活性。在s i R N A 方面通过对人及小鼠的M Y Sc D N A 序列的分析，选择了若干个区域作为s i R N A 的靶点，合成选中区域的正负链D N A ，退火后克隆到s i R N A 专用的载体p S u p p r e s s o r N e o ，目的基因在U 6 强启动子作用下可转录大量s i R N A 。同时又将全长的M Y Sc D N A 克隆至真核表达载体并转染C H O 细胞，获得表达人及小鼠M Y S 的C H O 细胞株。将构建的s i R N A 载体转染该C H O 细胞株，从中筛
6、选出对M Y S 表达有较强抑制作用的s i R N A 载体。目前筛选工作正在进行中。我们设想将筛选到有较强抑制作用的载体质粒注射到小鼠的肌肉组织，利用肌肉组织吸收质粒的特点，使质粒在肌纤维细胞中转录s i R N A ，观察在体内有无抑制M Y S 表达的作用。此外，我们拟用毕赤酵母表达的突变型p r o p e p t i d e 验证其体内抑制M Y S 活性的作用。国外有研究已经证实突变型p r o p e p t i d e 大量注射至动物体内后会竞争性的与C 段结合，从而抑制了C 端的生物学活性。我们正在进行的工作是纯化表达产物，然后将不同剂量的小鼠和人突变型p r o p e p t i d e 分别注射入小鼠体内，观察人突变型p r o p e p t i d e 是否能与小鼠突变型p r o p e p f i d e 一样，可以抑制小鼠体内M Y S 的活性。作者：黄庆生，博士，剐教授，西北工业大学生命科学院，E r n a i l ：q i n g s h e n 8 h y a h o o C O r nc n I# 通讯作者：薛小平教授西北工业大学生命科学院，陕西省西安市友谊西路1 2 7 号电话0 2 9 8 8 4 6 0 5 4 1
