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1、毒特有的一类酶。研究发现，越来越多的逆转录病毒( 艾滋病病毒、丙肝病毒、E B 病毒、单疱病毒、巨细胞病毒、流感病毒等) 能够传染人类及多种物种，引起免疫缺陷、白血病和淋巴 细胞癌等。在其复制过程中，形成新的逆转录病毒D N A ，整合到宿主细胞染色体中，激活或灭活细胞基因，引起突变和重 组。逆转录酶是一种依赖R N A 的D N A 聚合酶，是逆转录病毒特有的一种酶类，逆转录酶的基因存在于某些哺乳动物和禽类。逆转录酶是所有逆转录病毒中的一个重要标志，凡是逆转录病毒中均携带逆转录酶，逆转录酶活性的高低可即时反映逆转录病毒的感染程度，而不受病毒基因序列的影响。我们根据逆转录酶病毒所共有的逆转录酶
2、基因设计引物- 3 7 7 及探针，经荧光标记所建立的荧光产物增强逆转录酶活性分析( 期下一P E R T ) 定量方法，对献血员血样中逆转录酶活性测定，具有较高的使用价值。研究结果发现，逆转录酶经P C R 循环反应后可得到与理论值完全相符合的P C R 荧光值曲线；当A M V 逆转录酶稀释到1 0 _ 8 时，仍可得到相应的荧光值，证明具有较高的敏感性；在对献血员血样检测中发现，逆转录酶 活性筛选率达3 8 ，而在现用筛选方法中包括H I V 、H C V和H B V 总筛选率只有1 6 。因此，认为现用临床输血献血员筛选方法，并不能完全包含所有逆转录酶病毒类，可能检测不到所有检测献血员
3、中血样中的逆转录酶活性，对及时发现逆转录病毒感染，提高临床输血安全性有着十分重要的意义。快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究程晓东别良峰苏明权张荣岳乔红于文彬郝晓柯近年来，结核病疫情上升，耐多药结核病增多，给结核病控制带来了极大的困难。因此，检测结核分支杆菌耐药基因， 并用来指导治疗是一种新探索。1 9 8 9 年问世的P C R S S C P作为检测基因突变的方法，用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，由于不需要特殊的仪器，且经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，适合临床实验的需要。已有文献中采用S S C P 检测结核菌耐药是针对单基因进行的，尚未见采用m u l t i P C
4、 R S S C P 同时检测多个耐药相关基因突变情况的报导。研究表明，过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因( k a 如) 和( 或) 参与分支菌酸生物合成的烯酰基还原酶编码基因( i n h A ) 和( 或) o x y R a h p C 间隔区( 即a p h C 启动子区域) 的 突变是结核分支杆菌耐I N H 产生的主要机制。本研究采用 m u l t i P C R 技术一次性特异地扩增出与耐I N H 相关的这三个基因，并将此扩增产物直接进行S S C P ，检测基因突变的情况，并与测序结果相比较，参照药敏结果，探讨该方法的实用性和可行性。为以后深入研究耐药基因检测奠定良好的基础
5、。材料和方法一、材料 1 菌株：结核分支杆菌标准株H 3 7 R v ( 菌株号：A ，1 1 C ：C 2 7 2 9 4 ) 由本室保存。5 8 株临床分离株由西安市结核病防治医院提供。2 主要试剂和仪器：基因扩增仪为美国P E 公司产品；聚合酶链反应( P C R )体系为华美生物工程公司产品；胶回收试剂盒为C o n t e c h 公司产品；质粒小量提取试剂盒，p G E M ( r ) 一TE a s yV e c t o r 均为P r o m e g a 公司产品。垂直电泳槽为美国B i o R A D 公司产品，紫外分光光度计为美国P E 公司。3 引物设计：a p h C
6、基因特异性引物根据G e n b a n k ： U 1 6 2 4 3 的序列设计，扩增片段为3 1 1 b p ；i n h A 基因特异性引物根据G e n b a n k ：U 0 2 4 9 2 的序列设计，扩增片段为3 9 5 b p ； k a t G 基因特异性引物根据E M B L ：X 6 8 0 8 1 的序列设计，扩增作者单位：7 1 0 0 3 2 西安，第四军医大学西京医院检验科片段为4 5 8 b p 。以上引物经P r i m e r i o rA r r a y 多重引物设计软件分析后，由上海生工生物工程公司合成。二、方法1 药敏试验：按全国结核病细菌学检验标
7、准化规程进行分支杆菌培养，菌种鉴定及药敏试验。2 细菌D N A 的制备及基因扩增：参照文献操作。3 S S C P ：单基因P C R 产物经变性后形成两条或三条单链，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现一到三条带。通过与标准株D N A 扩增产物对照，若呈现泳动异常，则判定存在基因突变。将临床分离株与结核分支杆菌标准株的D N Am u l t i P C R 扩增产物加在同一块1 0 ( 4 9 ：1 ) 非变性聚丙烯酰胺凝胶中，1 0 4 0 0 V 电泳1 0 分钟，再1 5 0 V 电泳1 5 小时，银染色后观察结果并照相。4 耐药菌株M u l t i P C R 产物的测序分析：将
8、m u l t i P C R 产物分别切下，进行胶回收、连接T 一载体、转化J M l 0 9感受态细胞、提取质粒D N A 、酶切鉴定，最后送上海申友生物技术有限责任公司测序。 结果一、结核分支杆菌临床分离株的药敏试验： 在5 8 株临床分离株中，I N H 耐药株3 5 株，耐药率为6 0 ，其中高度耐I N H2 7 株，低度耐I N H8 株，药物敏感株2 3 株。二、扩增结果：1 基因扩增结果：除有2 株高耐药株在单独扩增时，k a t G 基因扩增阴性，而其它两个基因单独扩增均是阳性，从而提示k a t G 基因可能缺失。其余分离株的l 【a t G 基因、i n h A 基因、
9、a p h C 启动子 基因均扩增成功。常规P C R 和m u l t i P C R 同时扩增。2 单基因P C R S S C P 结果6 。3 M u l t i P C R S S C P 电泳：对5 8 株临床分离株分别进 行M u l t i P C R S S C P 分析。2 3 株敏感株的上述基因片段S S C P 均泳动正常，说明所选片段进行S S C P 分析的特异性为 1 0 0 。以结核分支杆菌H 3 7R v 标准株作对照，泳道1 ，4 为I N H 敏感株，2 ，3 ，5 ，6 ，7 为I N H 耐药株。3 7 8 4 3 5 株耐药株上述基因片段K S C
10、P 结果：a p h C 启动子序 列突变检出率1 7 1 ( 6 3 5 ) 、i n h A 序列突变检出率2 0 0 ( 7 3 5 ) 、k a t G 序列突变检出率6 5 7 ( 2 3 3 5 ) ；总突变检出率8 2 9 ( 2 9 3 5 ) ( 附表1 ) 。附表1 结核分支杆菌耐I N H 基因P C R S S C P 分析结果组别a p h C 启动子i n h A 基因k a t G 基因分离株数高耐药株+一缺失2+一一1+一l+l一+一1一+2一+1 3低耐药株+一一1一+一2一一+5合汁672 32 95 耐药菌株测序结果：重组质粒p O E M a p h C
11、 ( i n h A k a 好) 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序引物 使用M 1 3 ( + ) M 1 3 ( ) 。经序列测定分析，结果与已知序列相比。6 测序结果与S S C P 结果的比较：测序法检出a p h C 启动 子突变7 株( 其中一株为结构基因部分突变) ，检出率2 0 0 ( 7 3 5 ) ；i l f l l A 基因突变1 2 株，检出率3 4 3 ( 1 2 3 5 ) ；k a t G 基因突变2 4 株，检出率6 8 6 ( 2 4 3 5 ) 。测序法共检出3 0 株突变株，检出率为8 5 7 ( 3 0 3 5 ) 。测序法与K S C P
12、 法相比较，a p h C 启动子基因突变检测符合率为9 7 1 ( 6 + 2 8 3 5 ) ，i n h A基因突变检测符合率为8 5 7 ( 7 + 2 3 3 5 ) ，k a t G 基因突变检 测符合率为9 7 1 ( 2 3 + 1 1 3 5 ) ，总突变检出符合率为9 7 1 ( 2 9 + 5 3 5 ) 。 讨论结核病是单一病菌引起死亡最多的传染病，重要原因之一是因为结核菌具有极高的耐药率。传统的耐药性检测方法是建立在生物生长代谢过程中的表现性上，这种方法需时长，通常为8 2 0 周，且敏感性低，不能满足现代短程化疗需求。因此，从分子水平阐明结核菌耐药性变异的机制，建立
13、敏感、快速和特异的检测方法，是目前迫切需要解决的问题。基因诊断技术作为结核杆菌非培养技术是近年来结核病快速诊断的一项重大突破，它是以分析结核杆菌的遗传物质一核酸而达到特异、敏感、快速的检测和鉴定结核杆菌的目的。目前较为成熟的基因诊断方法有D N A 直接测序法、杂交、P C R S S C P 等。而S S C P 又以其操作简便和费用较低等优点，更适合在临床推广使用，为临床快速、简便鉴定结核杆菌耐药基因突变开辟了新领域。K S C P 法尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核菌株对照，条件掌握不好差异不易区分等，但仍 不失为一种具有广泛应用前景的方法。由于结核分支杆菌的耐药基因数量很多，
14、逐个进行P C R S S C P 分析仍然十分麻烦，且费时费工。所以，建立一套结核杆菌多基因耐药的快速检测技术，使耐药检测时间缩短到1 2 天，实现早期、迅速对结核患者耐药性进行检测是非常必要而且有重要意义的。m u l t i P C R S S C P 结果显示a p h C 启动予、i n h A 基因突变多发生在高耐药株中。a p h C 启动子突变检出率1 7 1 ，与吴雪琼等报道的检出率很近似。i n h A 突变检出率2 0 0 ，低于朱中元等报道的检出率，可能是本实验所选取的i n h A 片段 不到1 2 全序列所致。实验中有2 株( 6 ) 高耐药株k a 如基因扩增阴性
15、，说明k a t G 基因完全或部分缺失，但绝大多数 I N H 耐药菌株k a t G 基因表达，k a t G 基因缺失率很低。k a t G的突变检出率为6 5 7 略高于张宗德等报道的检出率，说明适当延长扩增区域，可将更多的突变位点函概其中，提高了检 测效率。a p h C 启动子基因和k a t G 基因S S C P 法突变检出率与测序法突变检出率十分接近，符合率都为9 7 1 ；i n h A 基 因突变检测符合率为8 5 7 ，i n h A 基因S S C P 结果低于测序结果，说明所选的i n h A 基因片段两条单链空间构象相似，而 导致突变位点对空间构象的改变贡献不大，
16、降低了, S C P 的检出率。相反，a p h C 启动子基因和k a t G 基因单链之间构象 差别大，个别位点突变就能改变单链的空间结构。但总体来看，两种方法的突变检出符合率为9 7 1o k ( 2 9 + 5 3 5 ) ，这是因为i n h A 基因突变大多同时伴有k a t G 基因的突变，所以本试验方法仍能高效的检出耐异烟肼结核分支杆菌的基因突变情况。根据金月玲等的报道，采用丙烯酰胺：亚甲基双丙烯酰胺= 4 9 ：1 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，可以使电泳条带分得更开，加入尿素可使条带更狭窄和更清晰，更容易判读电泳结果。另外，因为使用的P C R 产物未作纯化，其中的非特异扩增产物对同源和异源双链的形成都有较大的影响，可能引起电泳条带模糊不清。因此我们对m u l t i P C R 扩增条件作了严格的优化，为最大限度的减少非特异产物的干扰。一般K S
