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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 5 在大鼠急性脑缺血中的变化在大鼠急性脑缺血中的变化作者：张茂林 刘俊平 杨巧莲 周立社 吴跃华 作者单位：(包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古包头 014010;包头医学院生物化学与分子生物学教研室)【摘要】 目的：观察大鼠大脑皮质中代谢型谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律，探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法：35 只雄性 Wistar 大鼠随机分为正常对照组、脑缺血 1h 组、3h 组、6h 组、12h 组、24h 组(均为手术组)及其相对应
2、的假手术对照组，采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，至上述规定时间点取大脑组织，行 HE 染色，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组mGluR5 表达的灰度值。结果：各手术组 mGluR5 表达均高于假手术对照组及正常对照组，与正常对照组相比，缺血 1h 其表达即有升高，至 12h 达高峰。而假手术对照组与正常对照组相比无统计学意义。结论：急性脑缺血可引起 mGluR5 表达上调，提示 mGluR5 参与了局灶性脑缺血损伤，可能促进了缺血性脑血管病的发展。但结合以前的研究，我们推测其上调也可能是一种为清除谷氨酸(Glu)而作出的
3、反应性增高，是一种维持机体平衡的自我保护机制。【关键词】 脑缺血;代谢型谷氨酸受体 5*基金项目：内蒙古自然科学基金资助项目(200208020618)KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Changes of Expression of mGluR5 Induced by Acute Cerebral Ischemia in RatsZHANG Maolin, LIU Junping, YANG Qiaolian, et al(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baotou Medical Colege, Baotou 0
4、14010，China)Abstract Objecive: To observe the expression of mGluR5 and the dynamic regulation in the cortex of rats with focal cerebral ischemia in different phases and to investigate its significance in acute ischemia .Methods:Thirty-five male Wistar rats were randomly divided into 11 groups: The n
5、ormal contral, sham operation and ischemic operation (subdivided into 1,3,6,12 and 24- hour) by middle cerebral artery occlusion model.Brain specimens of the rats from each group were obtained for HE staining and immunohistochemistry staining.To observe the damage of neurons with light microscope an
6、d to judge the positive expression of neurons, and then to detect the changes of gray scale value in each group.Results:Compared with the normal and each sham control group,the expression of mGluR5 in each ischemia operation group was elevated 1h after ischemia and reached the peak within 12 hours a
7、fter ischemia. However,there was was no significant difference between normal and sham control groups.Conclusion:Acute cerebral ischemia can cause up-regulated expression of mGluRs, suggesting that up-regulated expression of mGluR5 might be related with focal cerebral ischemia and KKME-专业医学搜索引擎 http
8、:/ contributed to the development of cerebrovascular disease.According to the results of previous study,however,we presume the up-regulated expression might be the responsive increase in order to remove glutamate, which is a protect mechanism for maintain balance of organism.Key words Cerebral ische
9、mia; Metabotropic glutamate receptor 5; Rat Immunohisitochemistry目前关于谷氨酸受体的研究很多，但多集中在离子型谷氨酸受体 NMDA 及其拮抗剂上。随着研究的深入，代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)在神经疾病中的作用日益受到重视。mGluR5 参与了中枢神经系统(CNS)的许多病理生理过程，但目前的研究并不深入。为了研究 mGluR5 在脑缺血中的作用机制，我们在 MCAO 模型基础上，动态研究 mGluR5 在缺血性脑血管病中表达的变化，以待从分子水平揭示 mGlu
10、R5 在脑缺血中的作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物及材料 健康 Wistar 雄性大白鼠 35 只，体重240280g，由内蒙古大学动物试验中心提供。兔抗鼠 mGluR5 多克隆抗体购自美国 Chemcon 公司;即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus 广谱试剂盒、DAB 显色试剂盒、APES、中性树胶为迈新生物技术(福州)产品。1.2 实验方法1.2.1 动物分组 将动物随机分为正常对照组(NC)、脑缺血KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1h 组、3h 组、6h 组、12h 组、24h 组(手术组，IG)及假手术对照组(SOC),每组 5 只。1.2.2 动物模型
11、制备 大鼠大脑中动脉缺血模型采用Koixumi 和 Longa 等方法1，大鼠用 3%戊巴比妥钠(0.10.15mL/100g)腹腔注射麻醉。麻醉大鼠仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。电凝 ECA 分支，结扎游离 ECA 主干。分离 ICA 主干至翼腭动脉(PPA)，结扎 PPA。ECA 残端剪一小口将拴线插入，轻推尼纶线尾端经 CCA 分叉部沿 ICA 入颅，进线深度由分叉部计算约18.50.5mm。这样便制成了大脑中动脉闭塞模型。假手术组除不插尼纶线外，其余步骤同缺血组。1.2.3 组织切片制备 分别在所须时间点，给予大鼠
12、 3%戊巴比妥钠 0.5mL 腹腔注射麻醉后断头取脑，自额极至枕叶分A、B、C、D、E5 等份取 C 脑片置于 4 4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定 24h，常规脱水，浸蜡，包埋，制成 5m 厚冠状切片。1.2.4 光镜观察 取各组大鼠组织切片，经 HE 染色后，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组 mGluR5 表达的灰度值。1.2.5 免疫组化法检测 mGluR5 采用辣根氧化酶链霉卵白素染色(SP 法)。1.3 图像分析 采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选取 10 个单位面积，测量免疫组化染色KKME-
13、专业医学搜索引擎 http:/ 统计学分析 采用 SPSS10.0 统计软件，各组数据均以均数标准差(xs)表示，两组间数据比较采用 t 检验，并进行方差齐性检验。P0.05 视为有统计学意义。2 结果2.1 神经细胞病理形态学改变 光镜观察正常对照组、假手术对照组神经细胞形态结构正常、核圆淡染、核仁明显，未见组织坏死(图 1);而手术组缺血灶内可见血管和神经元周围胶质成分肿胀，神经元呈三角形或杆状，胞核偏位并深染，有的甚至裂解、消失(图2);脑缺血时间越长，细胞变化越明显，缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶，灶内神经元残存较少甚至缺失。2.2 免疫组化结果 免疫组化阳性细胞信号呈棕黄色，在正
14、常组织内 mGluR5 主要位于细胞膜和胞浆内(图 3)，缺血后大脑皮层mGluR5 阳性神经元显著增加，有些神经元胞浆内着色亦增强(图 4)。与相应时间点 HE 染色结果比较，发现 mGluR5 强阳性神经细胞以缺血灶及其周围部位最为显著，但一些缺血较重的组织内看不到阳性神经元或仅有少量染色。另外，可见缺血灶内胶质成分呈颗粒状，背景染色较正常组浅。图 1 假手术对照组大鼠脑皮质(HE，200)(略)图 2 脑缺血后 24h 大鼠脑皮质(HE，200)(略)图 3 假手术对照组大鼠脑皮质 mGluR5 表达(200)(略)图 4 脑缺血后 24h 大鼠脑皮质 mGluR5 表达(200)(略)
15、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1h 即有逐渐降低，12h 为最低，故 mGluR5 表达于脑缺血后 1h 即有明显增加P0.05，12h 表达达高峰。详见表 1。表 1 各组 mGluR5 灰度值的变化(略)*与 NC 和相对应的 SOC 组比较，P0.053 讨论mGluR5 参与了 CNS 的许多病理生理过程,但目前的研究并不深入。据报道，mGluR5 与脑缺血、外伤、癫痫、帕金森病、疼痛及精神疾病等许多疾病相关2-5。目前关于 mGluR5 在缺血性脑血管病中的作用尚无定论。有资料报道 mGluR5 mRNA 在缺血性脑损伤中表达下调2，认为其发挥了保护作用;另一些则报道 mGluR5 mRNA 表达上调，有加重神经元损害的作用6。但关于其在缺血性脑血管病中的具体机理，目前并未阐明。多认为活化的 mGluR5 导致磷酸肌醇(phosphoino- sitide,PI)水解增加，引起二酯酰甘油和 IP3 的形成和胞内储存 Ca2+的活化7。目前克隆大鼠的 mGluR5 cDNA 总长度为 3 918bp(Genbank),编码 1 171 个氨基酸残基，组成 7 次跨膜蛋白。mGluR5 有三部分组成：第一部分为 N-末端细胞外功能域，第二部分为在胞膜处形成 7 个跨膜域，第三部分是细胞内功能域8。我们在大鼠 MCAO 模型的基础
