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1、原代培养原代培养 原理原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，将动物机体的各种组织从机体中取出， 经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂 （常用（常用 EDTA）或机械方法处理，分散）或机械方法处理，分散 成单细胞，置合适的培养基中培养，使成单细胞，置合适的培养基中培养，使 细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程 称原代培养。称原代培养。 仪器、材料及试剂仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至仪器：培养箱（调整至 37），培），培 养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、 吸管、移液管、纱布、手术器械、血球吸管
2、、移液管、纱布、手术器械、血球 计数板、离心机、水浴箱（计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块材料：动物组织块 试剂：试剂：1640 培养基（含培养基（含 20%小牛小牛 血清），血清），0.25%胰酶，胰酶，Hanks 液，液， 碘酒碘酒 原代消化培养法原代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于准备：取各种已消毒的培养用品置于 净化台面，紫外线消毒净化台面，紫外线消毒 20 分钟。开始分钟。开始 工作前先洗手、工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。酒精擦拭手至肘部。2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用
3、处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks 液漂洗液漂洗 23 次，去除血污；如次，去除血污；如 怀疑组织可能污染，可先置于含有青链怀疑组织可能污染，可先置于含有青链 霉素的混合液中霉素的混合液中 3060 分钟。分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成剪切：用眼科剪把组织切成 23 毫毫 米大小的块，以便于消化。加入比组织米大小的块，以便于消化。加入比组织 块总量多块总量多 3050 倍的胰蛋白酶液，然倍的胰蛋白酶液，然 后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞 以胶塞。以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于消化：或用恒温水浴，或置于 37 温箱消化均可，消化中
4、每隔温箱消化均可，消化中每隔 20 分钟应分钟应 摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更 好。消化时间依组织块的大小和组织的好。消化时间依组织块的大小和组织的 硬度而定。硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观 察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛， 滤掉尚未充分消化开的组织块。低速滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （5001000 转转/分）离心消
5、化液分）离心消化液 5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的分钟，吸出上清，加入适量含有血清的 培养液。培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细计数：用计数板计数，如细胞悬液细 胞密度过大，再补加培养液调整后，分胞密度过大，再补加培养液调整后，分 装入培养瓶中。对大多数细胞来说，装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH 要求在要求在 7.27.4 范围，培养液呈微红范围，培养液呈微红 色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用 NaHCO3 调整。调整。 8. 培养：置于培养：置于 36.5温箱培养，如用温箱培养，如用 CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺温箱培养
6、，瓶口需用纱布棉塞或螺 旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液 时需要换新塞。时需要换新塞。 原代组织块培养法原代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉 素小瓶中，用素小瓶中，用 Hanks 液漂洗二三次以液漂洗二三次以 去掉表面血污，吸静去掉表面血污，吸静 Hanks 液，用眼液，用眼 科剪反复剪切科剪反复剪切 1mm3 块为止。块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置 于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以布在培养瓶
7、底部，小块相互距离以 0.5cm 为宜，每一为宜，每一 25ml 培养瓶底可培养瓶底可 摆布摆布 2030 块。块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意 翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞， 置置 36.5温箱培养温箱培养 2 小时左右（勿超小时左右（勿超 过过 4 小时），使小块微干涸。小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，培养：从微箱中取出培养瓶，开塞， 46 度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入 培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转 过来
8、，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的 组织小块。置温箱中静止培养。待细胞组织小块。置温箱中静止培养。待细胞 从组织块游出数量增多后。再补加培养从组织块游出数量增多后。再补加培养 液。液。传代培养法传代培养法 原理原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基细胞在培养瓶长成致密单层后，已基 本上饱和，为使细胞能继续生长，同时本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代也将细胞数量扩大，就必须进行传代 （再培养）。（再培养）。 传代培养也是一种将细胞传代培养也是一种将细胞 种保存下去的方法。同时也是利用培养种保存下去的方法。同时也是利用培养 细胞进行各
9、种实验的必经过程。悬浮型细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型 细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经 消化后才能分瓶。消化后才能分瓶。 材料和试剂材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：试剂：0.25胰酶、胰酶、1640 培养基培养基 （含（含 10小牛血清）小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、 培养瓶、吸管、废液缸等培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤操作步骤 1. 吸除培养瓶内旧培养液。吸除培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和向瓶内加入胰蛋白酶和 EDTA 混合混合 液少许，以能覆满瓶底为
10、限。液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中置温箱中 25 分钟，当发现细胞质分钟，当发现细胞质 回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入吸除消化液，向瓶内注入 Hanks 液液 数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加液冲掉。注意加 Hanks 液冲洗细胞时，液冲洗细胞时， 动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流 失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰 蛋白酶液后，可不用蛋白酶液后，可不用 Hanks 液冲洗，液冲洗， 直接加入
11、培养液。直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁 细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份计数板计数后，把细胞悬液分成等份 分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。 无菌操作注意事项无菌操作注意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试新洁尔灭擦试。试 剂等瓶口也要擦试。剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常
12、在火焰上烧灼，金属器耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器 械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷 却后才能夹取组织，吸取过营养液的用却后才能夹取组织，吸取过营养液的用 具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，操作动作要准确敏捷，但又不能太快， 以防空气流动，增加污染机会。以防空气流动，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，不能用手触已消毒器皿的工作部分， 工作台面上用品要布局合理。工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持瓶子开口后要尽量保持 45斜位。斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。吸溶液的吸管等不能混用。
