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1、RT-PCR 原理与实验操作步骤原理与实验操作步骤关键词：关键词：RT-PCR 逆转录酶 reversetranscriptase 聚合酶 链式反应 引物设计 DNA 聚合酶一、知识背景一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA（每个 mRNA 存活4d，可以合成 105 个丝心蛋白） 共合成 109 个丝心蛋白。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸
2、存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2存在下，退火引物沿 5 3方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和 RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链；2、Rna
3、se 水解活性：水解 RNANA 杂合体中的 RNA；3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA.二、二、RT-PCR 的准备的准备：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为
4、1530bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。GC 含量（Tm 值）：4060，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 510 度。c、 3端要求：3端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的 3端最好选用 A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自
5、身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补，3端不应超过 2 个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是 G 或 C，使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0，Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡处理，除去 RNA 酶，防止操作过程中 RNA
6、降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经 DEPC 处理并高压的水。三、RNA 的提取方法：RTPCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活 性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑
7、蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异 硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。实验操作步骤实验操作步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头：1ml、200l、20l3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 20l 吸头的一个5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶：2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖）1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml
8、各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC 水11、铝制饭盒：4 个12、塑料小饭盒：1 个13、大瓷缸：2 个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP 管、匀浆管等）先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入 DEPC 水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP 管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC 水泡）（洗净后先泡 1DEPC 过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡 DEP
9、C）三、试剂配制：1、DEPC 水：吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1DEPC 水，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC 水配，然后放-20保存（其中 DEPC 水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml5TBE （贮存液）再将 5TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取 50ml 贮存液 450ml 水-500ml 工作缓冲液2、上样
10、缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青 FF30%甘油6缓冲液，4保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g 琼脂糖 100ml 电泳缓冲液，微波炉中火 30 秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至 60时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置 30-45min 后现进行电泳。2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为 1.5g六、需购置的 RT-PCR 材料：（生工. Tel. 2236106.）Taq 酶（含 MgCl2 Buffer） 200u 70.00dNTP: 1 支Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promeg
11、aM-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1 支 110- -20DEPC 5g 110.00Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies- 4Marker: 10g 0.2g/ml 150.00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）七、引物合成正义：5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3反义：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-32、par-4:正义：5-GGGACCTCGGAACTCAAC-3反义：5-TGTATCTGCCTGGGACT
12、G-33、退火温度计算2（A T） 4（G C）正反义平均数，再上下波动度（4，或5）4、引物各合成 5 OD，每 OD 一瓶分装好5、引物稀释：加 DEPC 水量为（l）= ? nmol / OD 管上所标 OD 数100是为 10p mol / l 浓度的引物溶液八、PCR 产物电泳先将 1-10l 左右 PCR 产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为 10mA，电源 100V，电泳 30 分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt 时，先打开 PCR 预热 30 分钟。3、RNA 抽提前，打开离心机预冷。TR
13、Izol 法抽提总 RNA细胞 1107组织 100mg加 1mlTRIzol细胞用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至 EP 管）（组织匀浆量100mg 时分装 1ml/每 EP 管）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟加氯仿 1/5 体积（0.2ml）（必须按总体积的 1/5）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟4，离心 12000g，15 分钟转上层水相（约 400l）于另一 1.5mlEP 管中加等体积异丙醇（约 400l），混匀室温 10 分钟4，离心 12000g，10 分钟弃上清加冰预冷的 75%乙醇（用 DEPC 水配）1ml4离心 7500g，5 分钟弃上
14、清，空气干燥 5-10 分钟（不能完全干燥）溶于 DEPC 水中至 20l（10l-20l）（可在 55-60水中，10 分钟助溶）注：1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则 DEPC 溶解2、细胞组织加 TRIzol 匀浆后，可在-60放置至少一个月（甚至可一年以上）3、RNA 在 75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年两步法 RT-PCR（第一步：逆转录反应）试剂 浓度 体积 终浓度RNA 23l(11.5l)Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l（稀释 10 倍后用）混匀，离心，70 5min立即冰水浴，稍离心试剂 浓度 体
15、积 终浓度M-MLV Buffer 5 8l (4l) 1dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mMRNasin 40U/l 1l (0.5l) 20M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U总体积 40l（20l）混匀，离心，42 60min95 10min（破坏 MLV）4保存两步法 RT-PCR（第二步：PCR 反应）总体积 20l(50l)试剂 浓度 体积 终浓度Taq Buffer 10 2l (5l_) 1MgCl2 25mM 1.2l (3l) 1.5mMdNTP 10mM 0.2l (0.5l) 200uM上游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol下游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmolcDNA 模板 X (?) (1-10l)DEPC 水 20l-4.3l-X
