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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 噬菌体的培养纯化和噬菌体的培养纯化和 DNA 的提取的提取 噬菌体是分子克隆工作中最常用的基因载体之一。 噬菌体基因组所含 DNA 是由 48，502bp 组成的线性双链分子。DNA 的两个末端各有一个十二核苷酸长的 5突出单链，而且两单链的碱基顺序是互补的。当噬菌体感染宿主大肠杆菌细胞后，DNA 链借其单链粘性末端能使自身环化，并以环状分子的形式在转染的早期进行DNA 的复制及转录作用。DNA 的复制可以有两条途径：DNA在宿主体内环化后即行复制，并合成出大量的噬菌体基因产物和生成无数的子代噬菌体。随着它们的生成和成熟，最终导致宿主细胞的裂解。释放出
2、来的噬菌体又可感染其它宿主细胞。这是噬菌体的裂解生长过程;另一途径是溶原生长。进入到细胞内的噬菌体基因组被整合到宿主的染色体 DNA 中，它随着宿主细胞的染色体 DNA一起复制和传入宿主的子代细胞中。对 噬菌体分子生物学的深入研究，包括 DNA 各基因功能的阐明，全部核苷酸序列的测定和基因谱的分析，加上人工包装噬菌体的成功，DNA 作为分子克隆的载体已被广泛使用。目前已从 噬菌体 DNA 人工构建成二十余种有用的载体，例如 Charon 系列载体，EMBL3-4，gt10，gt11，gt18-23 系列，2001，DASH，Fix，ZAP，ORF8 等载体。大大增加了噬菌体在分子克隆工作中的应
3、用范围。 噬菌体的纯化和 DNA 的制备是现代核酸技术中常用的方法之一。这一节将简单介绍 噬菌KKME-专业医学搜索引擎 http:/ DNA 制备方法。一、噬菌体的原种制备和培养要想获得大量的噬菌体，首先得用噬菌体感染宿主细胞。大肠杆菌是 噬菌体的宿主菌。但是，对于不同的 噬菌体载体，需要按载体对宿主菌遗传性状的不同要求，仔细选择合适的大肠杆菌的合适菌株，例如：野生型 噬菌体可用 C600 菌株，Charon 系列可用 LE392 菌株，gt11 可选用 Y1090hsdR 菌株，EMBL3-4 可选用 NM538 菌株，2001，DASH 和 FIX 可选用 NM539 菌株，gt10 扩
4、增载体可选用 C600 菌株，筛选重组 gt10 可选用BNN102 菌株等等。感染后的宿主细胞在大体积培养基中培养，初期，因噬菌体的浓度低，未感染的细胞就在培养的开始几小时(34小时内)大量繁殖，而被感染的细胞随着感染和裂解的反复发生，最终使几乎全部的细胞均被裂解。只要最初感染时噬菌体和宿主细胞之间的比例合适，就可以得到足够量的噬菌体。对于不同型载体噬菌体和不同的宿主菌来说，感染时两者的最佳比例并不相同。合适的比例需实验者自己摸索。比例范围一般在 150500 之间不等。对于生长旺盛的 gtWESB，比率为 1200，每 11010 细胞只需用 5107 噬菌体去感染;而不易繁殖的 Char
5、on 系列载体，比率是 120 左右，相同数量的宿主细胞得用 5108 噬菌体进行感染。(一) 噬菌体的平板培养和原种的制备1.试剂的配制：LB 培养基：于 900ml 水中加入 10g 胰蛋白胨，5g 酵母提取物，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 氯化钠，溶解后用 NaOH，调节 pH 到 7.0，补水到 1L，高压灭菌 20 分钟。NZCYM 培养基：于 900ml 水中加入 NZ 胺 10g，NaCl5g，酪蛋白水解物 1g，MgSO47H2O2g，用 NaOH 调整节 pH 到 7.0，补水到 1L，高压灭菌 20 分钟。SM 缓冲液：称量 NaCl5.8g，MgSO47H2O
6、2g，2%明胶溶液5ml，1mol/LTris-Cl(pH7.5)50ml。加水到 1L。高压灭菌 20 分钟后，分装成 50ml 一份于灭菌小瓶中，可室温保存。2. 噬菌体的平板培养：(1)取一消毒的 250ml 烧瓶，加入 50ml 灭菌的含 0.2%麦芽糖的加富培养液(如 NZCYM 或 LB)，接种一个 噬菌体的合适的受体菌株的单菌落，于 37适度振摇(摇床 250r/min)培养过夜。加麦芽糖后细菌更容易吸附 噬菌体，因为 噬菌体受体编码基因(lamB)位于麦芽糖操纵子内，而麦芽糖可诱导麦芽糖操纵子。(2)于室温以 4000g 离心 10 分钟，倾出上清液，加入约 20ml 灭菌的
7、0.01mol/LMgSO4 溶液，振荡悬起细菌沉淀。(3)用 SM 将噬菌体原种连续 10 倍稀释。取每个稀释度的噬菌体悬液 0.1ml 加入一灭菌试管(13mm100mm)中。(4)各加入 0.1ml 上述培养好的宿主菌，轻摇或振荡混匀。于37温育 20 分钟，使噬菌体颗粒吸附于细菌。(5)取 3ml 熔化并于 47保温的 0.7%琼脂糖或琼脂加入第一支试管内，轻轻振荡后，立即倒入一含 3035ml 凝固的底层琼脂培养KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 或 LB)的平板内。注意勿产生气泡。轻轻晃动平板，以使细菌和顶层琼脂或顶层琼脂糖分布均匀。对其余的试管也依次如法制备。贮存于 4的含
8、凝固的底层琼脂的平板用前应取出于室温平衡 12 小时。这样可以消除冷凝的问题并可以使顶层琼脂在平板凝固以前均匀分布于平板的整个表面上。(6)盖上平板，于室温放置 5 分钟以使顶层琼脂或顶层琼脂糖凝固。将平皿倒置于 37培养。培养 7 小时后噬菌斑开始出现，1216 小时后可以计数或挑选噬斑。3. 噬菌体原种的制备：(1)取 1mlSM 置于试管(13mm100mm)中，加入一滴氯仿。(2)取一装有橡皮头的吸管或微量移液器，刺入挑选的噬斑直至底层琼脂，轻轻抽吸将噬斑与底层琼脂一并吸入管内。(由于 噬菌体在顶层琼脂中可以扩散至较远距离，应该挑选一个分隔良好的噬斑。)(3)将所挑取的含噬斑的琼脂颗粒
9、置于准备好的 SM/氯仿中，于室温放置 12 小时，以使噬菌体颗粒于 SM/氯仿中可无限期贮存而不丧失活性。(贮存时间太长的氯仿可使 噬菌体失活。用新鲜蒸馏的氯仿或经无水碳酸氢钠抽提去除光分解产物的氯仿可避免这一问题。)(4)50100l 上一步所制备的噬斑 SM/氯仿悬液(105 到 106pfu的噬菌体)加入 0.1ml 宿主菌细胞于 37温育 20 分钟。(pfu 为噬斑形成单位，1 个 pfu 实际上就是 1 个噬菌斑)。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3ml 融化的琼脂或琼脂糖(0.7%)，混匀后，迅速倾入一做好标记，含 3035ml 已凝固的底层琼脂的 90mm 平皿中。
10、(刚刚灌制并平衡到室温的平板所得结果最好，但 14 天前制备的平板还可使用。)(6)在 37培养 68 小时，直到噬斑几乎布满平板，只有相邻噬斑接合部位的边缘尚可见到菌苔。(7)从培养箱中取出平板，加入 5mlSM，置于 4几个小时，间或轻轻摇晃。(8)用吸管尽量吸取平板中的 SM 溶液，放入一试管(13mm100mm)中。(9)在平板中加入 1mlSM，倾斜放置 15 分钟以使液体集中在一个区域。吸取平板中的 SM，与第一次的收获物合并，弃去平板。(10)在收获的 SM 中加入一滴氯仿，贮存于 4。噬菌体原种的滴度约为 10101011pfu/ml，并且只要贮存于 4，滴度不会发生变化。在含
11、少量氯仿(0.3%)的 SM 溶液中，大多数 噬菌体株的原种可于 4贮存几年。为避免失活，可采用新鲜蒸馏的氯仿或用无水碳酸氢钠抽提而去除光分解产物的氯仿，每 23 个月检查一次噬菌体原种母液的滴度，重要而基因型已确定的 噬菌体的贮存母液应于负 70贮存。贮存前，噬菌体原种母液中还应加入终浓度为7%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)。轻摇混匀后，将容器置于液氮中。待管内液体冻结后，将贮存管置于-70冰箱中长期保存。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 18 号针头挑取冻结的液体表面，然后在含适当指示菌的平板表面划线。在适宜的温度下培养 12 小时，使形成噬斑。挑选一个分隔良好的噬斑，用上述的
12、方法制备高滴度噬菌体原种。(二) 噬菌体的大量培养1.在 100mlNZCYM 培养基中接种一宿主菌的单菌落，37下振荡过夜。2.过夜的菌液经稀释后测 600nm 下的光密度值(即 OD600 值)以计算出原液的 OD600 值。按 1OD6008108 细胞/ml 培养液，换算出每毫升培养所含细胞数目。按此换算可知，若有 5mlOD600 为2.5 的菌液，其所含细菌数应为 11010。3.吸取相当于含有 11010 细菌数的过夜培养液，分别移入四支可离心用的无菌试管中，室温下 3，500r/min 离心 15 分钟。离心后弃上清液，无菌条件下分别向每管中加入 3mlSM 缓冲液以悬浮菌体。
13、4.按预先测知的噬菌体和细菌的最佳比例(在 150500 之间)向每管宿主菌悬液中加入噬菌体。然后在 37水浴中间隙振摇 20分钟，以使噬菌体感染宿主菌。5.经感染后的细菌(每份有 11010 细胞)种入含 500mlNZCYM培养基的 2L 容量的无菌三角瓶中，在 37恒温室内进行振荡培养。一共接种四瓶，总的培养液为 500ml4。在接种前，最好把每瓶培养液先预热至 37。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 34 小时培养中，宿主细胞可大量繁殖，以后被裂解的细胞就逐渐增多，一般在 912 小时之内可到完全裂解。培养七小时之后，可以检查裂解程度。方法是在无菌条件下取出 1ml 感染的菌液
14、二份，分别移入试管中，在一管中加入 12 滴氯仿，另一管不加氯仿作对照，然后在 37摇 510 分钟，比较二管菌液的清亮程度。如果加有氯仿的菌液比对照的明显地清亮，说明噬菌体在宿主细胞中繁殖良好。(6)若经上述的检测，证实细胞虽未被裂解，但查噬菌体生长良好时，即可向每个三角瓶的培养液中加入 10ml 氯仿，继续振荡 30分钟，以促使细胞裂解。在裂解充分的菌液中，可见到相当量的细菌碎片，它们聚集成絮丝状的沉淀物。若对着光线观察，裂解液呈清亮液体，除絮丝状物外，几乎见不到未裂解的悬浮细胞。二、噬菌体的纯化(一)聚乙二醇沉淀和氯化铯密度梯度离心法1.将裂解液冷却至室温，按 1g/ml 裂解液的比例向
15、裂解液加入RNase 和 DNase(二种酶液均配成 5mg/ml 的浓度)，室温下保温 30分钟，消化来自宿主细胞的核酸。此时，包裹于噬菌体中的 DNA不受影响。2.把固体氯化钠加入上述裂解液中，使终浓度为1mol/L(29.2g/500ml 裂解液)，摇匀后在冰浴中放置 60 分钟，在 4下 4，000r/min 离心 30 分钟。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 10%(W/V，50g/500ml 上清液)，在室温下借电磁搅拌使之溶解完全。然后，再于冰浴中放置 1 小时以上或 4下过夜，使噬菌体沉淀。4.在 4下 4，000r/min 离心 30 分钟，弃去上清液，并把离心管倒置 5 分钟，滴尽管中液体。5.得到的沉淀用 SM 缓冲液悬浮，加液的量不得超过 5ml/500ml上清液，因为过大的体积会给用氯化铯分级梯度离心纯化噬菌的步骤带来麻烦。此外，在悬浮噬菌体时要特别注意，动作缓和，并使用粗口的滴管，以防噬菌体受破坏
