HCV非结构蛋白和结构蛋白在复制和感染中的作用

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1、HCVHCV 非结构蛋白和结构蛋白在复制和感染中的作用非结构蛋白和结构蛋白在复制和感染中的作用【摘要】 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)在 1989 年即已分离获得,但由于 HCV 很 难在体外培养且在血中滴度很低,一直阻碍了 HCV 的研究和抗病毒药物的开发,因此 HCV 体 外培养细胞模型和小动物模型的建立是 HCV 研究的关键问题之一。基于 HCV 2a 型 JFH1 株 的细胞模型的建立解决了部分难题。JFHI 株是由 Kato 等于 2001 年从日本 1 例暴发性丙型 肝炎患者体内获得的,其基因型为 2a,JFH1 能在体外高效复制并产生感染性的病毒颗粒。

2、但 迄今为止,无需突变即能在体外高效复制并产生感染性病毒颗粒的仅限于 JFH1 株,而 JFH1 株不能完全代表其他主要基因型的流行特征。因此建立能够支持其他基因型尤其是我国最 主要的基因型 1b 型复制的细胞培养系统成是当前 HCV 研究的迫切任务。自 1999 年复制子 模型系统被首次描述以来,人们通过对复制子的研究发现,NS5A 蛋白是参与 HCV 复制的重要 因子,NS5A 通过与其他复制蛋白作用后,形成一个激活的复制复合体,起始 HCV 在体内的复 制。复制子的非结构基因在体外细胞培养中会发生适应性突变(adaptive mutation),将适 应性突变预先引入复制子中能够提高克隆

3、形成率(efficiency of colony formation,ECF), 适应性突变一般出现在 NS3、NS4B 和 NS5A 区,部分突变位点之间有协同效应,其中 NS5A 的 适应性突变导致高度磷酸化的 NS5A 蛋白形式(p58)下调,从而促进亚基因组或全基因组的复 制;或者是突变后与其他的复制阻遏蛋白的结合变弱,促进复制复合体的形成,从而也促进复 制子的复制。HCV core 蛋白的氨基酸序列十分保守,在各型中的同源性达到 95%。Core 蛋 白在包裹病毒 RNA,维持其固有的外在形态和病毒所致持续感染中发挥关键作用。HCV 的结 构基因和非结构基因产物之间的相互作用对细胞培

4、养中产生的 HCV 感染性颗粒是至关重要 的。Core 蛋白在 HCV 的感染颗粒包装和产生中起重要作用。已有研究表明,HCV 在 core 蛋 白表达受阻的情况下,其病毒的复制会在一定程度受到抑制,但对于 core 蛋白具体的作用机 制,目前相关的研究还很少。病毒入侵感染的首要步骤是与宿主细胞膜上的相应受体结合, 形成一个配体-受体复合物。HCV 结构蛋白中包膜蛋白 E,就是这样一种受体结合蛋白,以 E1/E2 二聚体的形式,与宿主细胞膜上的 CD81,SR- BI,claudin1,occludin 等分子结合后, 以复合体的形式介导 HCV 的入侵。乙型脑炎病毒(JEV)和 HCV 都属

5、于黄热病毒,基因结构非 常相似,均为单股正链 RNA 病毒。JEV 结构蛋白中的囊膜糖蛋白 E,也是介导 HCV 入侵细胞的 关键分子。JEV 不仅能感染人,也能感染小鼠。已有报道,HCV 的 JFH1 株,能在小鼠细胞内复 制,但是不能包装出具感染性病毒颗粒。因此,在本研究中我们用基因置换的方法研究 NS5A、C 以及 E 区置换对 HCV 复制和感染的影响,以期为建立 1b 基因型的细胞培养模型以 及小动物模型建立基础。本研究首先比较 J4NS5A 基因置换 FL-J6JFH1 相应区域后构建的嵌 合子 FL-J6JFH/J4NS5A 与野生型 FL-J6JFH1 复制和感染的差别。接着用

6、人工定点突变的方 法对嵌合子 NS5A 的三个复制相关位点氨基酸改变 (S2197P,S2201del,S2197P+S2201del,S2197P+S2204I),比较突变前后复制能力的差别。同 时用基因置换的方法用 J4 core 平行置换 FL-J6JFH1 构建嵌合复制子 FL-J6JFH/J4core,比 较置换前后复制能力的差别。此外,本研究还用同属黄热病毒的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的 E 区基因置换 HCV 的相应区域,构建了 HCV/JEV 嵌合复制子,比 较 HCV 细胞亲嗜性的改变,以期建立跨种感染的 HCV 细胞模型。

7、一、JFH1 NS5A 基因置换对 FL-J6JFH1 复制和感染的影响以我国 HCV 最主要基因型(1b 型 J4 株)的 NS5A 替换 FL-J6JFH 的相应基因得到嵌合型 FL-J6JFH/J4NS5A,与野生型 FL-J6JFH1,以及复制缺陷型阴性对照 FL-J6JFH(GND)线性化后体外转录成 RNA,用脂质体分别转染 Huh-7.5.1 细胞。比较三者转 染细胞在培养过程中 HCV RNA 水平差异。转染后第 5,8,12 天抽提细胞总 RNA,逆转录成cDNA 后作为模板,以 HCV 特异的荧光定量 PCR(FQ RT-PCR)检测细胞内 HCV 的 RNA 水平。结 果

8、显示,在检测的三个时间点上嵌合体转染细胞内 HCV RNA 水平一直低于野生型转染的细胞。 在第 5 天,FL-J6JFH 转染细胞内 HCV RNA 为 1.1106 GE/g RNA,第 8 天,下降到 9.5105 GE/g RNA,此后 RNA 水平明显上升,第 12 天上升到 4.6106 GE/g RNA。而 嵌合体 FL-J6JFH/J4NS5A 的 HCV RNA 水平则维持在一个较低且稳定的水平(104 GE/g RNA 以上)。阴性对照 FL-J6JFH(GND)转染细胞后 HCV RNA 很快被宿主细胞清除。以丙型肝炎患 者血清为一抗,免疫荧光检测转染细胞内 HCV 蛋白

9、的表达,在第 3、5、8 和 12 天 FL-J6JFH1 和 FL-J6JFH/J4NS5A 转染的细胞内都可以检测到 HCV 蛋白表达,FL-J6JFH/J4NS5A 转染细胞 的荧光强度要显著低于野生型 FL-J6JFH 转染细胞,而对照的 FL-J6JFH(GND)转染则没有检 测到 HCV 蛋白阳性细胞。上述结果表明,野生型 FL-J6JFH 和 NS5A 置换后的 FL- J6JFH/J4NS5A 都能在 Huh7.5.1 细胞中长时间有效复制,FL-J6JFH/J4NS5A 的复制能力较野 生型有很大程度降低。收集 FL-J6JFH/J4NS5A 和 FL-J6JFH 转染细胞的

10、上清(d3、d 5、d 8、d 12),感染 na?ve Huh-7.5.1 细胞,72h 后免疫荧光法检测 HCV 蛋白阳性细胞,结果都可 见 HCV 蛋白的表达,但 FL-J6JFH/J4NS5A 的蛋白表达水平要显著低于野生型 FL-J6JFH。上 述结果表明,FL-J6JFH 和 FL-J6JFH/J4NS5A 转染细胞后,都能产生具有感染性的病毒颗粒 (HCVcc)。不同的是,FL-J6JFH NS5A 被置换后,病毒的复制、蛋白的翻译以及感染性病毒颗 粒的分泌都显著降低,说明了 JFH NS5A 在 FL-J6JFH 体外高效复制中起重要作用。野生型 FL-J6JFH 转染后第 9

11、 天始,可见明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),在细胞培 养物中持续出现大量不贴壁的细胞,且细胞生长速度变缓并批量死亡。而嵌合体转染的细胞 内没有这种效应。这也说明 FL-J6JFH/J4NS5A 产生的病毒滴度要低于野生型,嵌合体无 CPE 效应,因此可能更加接近天然的 HCV 病毒颗粒,为我们下一步工作提供了一个理想的实验平 台。二、NS5A 定点突变对置换后 HCV 复制能力下降的代偿作用采用人工定点突变的方法, 将 HCV NS5A 的 2197 位上的丝氨酸突变成脯氨酸(Ser-Pro),2201 位上丝氨酸缺失 (deletion),和 2204 位上

12、的丝氨酸突变成异亮氨酸( Ser-Ile ),构建四个突变复制子,即 FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL- J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和 FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)。将四个突变子和 未突变的 FL-J6JFH/J4NS5A 体外转录后分别转染 Huh7.5.1 细胞,转染后第 10 天收集细胞进 行 RNA 和蛋白检测。用 HCV 特异性引物进行 PCR 定性检测,在转染后第 10 天所有的复制子 都检测到了特异性大小的 HCV 条带。荧光定量 PCR 检测突

13、变前后复制子 RNA 转染细胞内 HCV RNA 的水平。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)和 FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)转染细 胞内 RNA 水平相较突变前有了提高。RNA 水平最高组为 FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I), 第 8 天细胞内 RNA 水平为 5.3105GE/ug RNA,为突变前 FL-J6JFH/J4NS5A 第 8 天细胞内 RNA 水平的约 120 倍( 4.2104GE/ug RNA )。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和 FL- J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2

14、201del)与突变前相比,细胞内 RNA 水平有所下降,其中最低为 FL- J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del),转染细胞后第 8 天,为 3.3103 GE/ug RNA,约为 RNA 水 平最高组的 1/160。免疫荧光染色检测转染细胞内 HCV NS5A 蛋白的表达情况,与突变前 FL- J6JFH/J4NS5A 相比,突变后的 FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和 FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+2201del)的 HCV 阳性细胞数明显减少,最少的为 FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+ 2201del),在转染后第 5

15、 天和第 10 天,几乎不可见阳性细胞。FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del) 的阳性细胞情况与突变前相似。表达 HCV 蛋白阳性细胞数最高的是 FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+S2204I),第 10 天阳性细胞数约占整个细胞数的 60%,远远高于突变前的 5%。以上 结果表明,J4 的 NS5A 的 2197,2201,2204 位点上丝氨酸对 HCV 的复制和蛋白产物的生成有 着重要的作用,在一定程度上决定着 HCV 的复制和蛋白翻译的能力。三、Core 区基因能置 换对 FL-J6JFH 病毒复制影响的研究采用基因置换的方法(Gene swapping),用

16、我国 HCV 感染最常见的基因型(1b 型 J4 株)的 core 区基因替换了 FL-J6JFH 的相应基因,构建基因型间嵌 合体 FL-J6JFH/J4core。将 FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4NS5A 和 FL-J6JFH/J4core 用 Xbal1 线 性化后,体外转录成 RNA,用脂质体介导转染 Huh7.5.1 细胞。转染细胞传代培养,转染后第 5 天用 FQ RT-PCR 方法检测转染细胞内 HCV RNA 水平。结果表明,FL-J6JFH/J4core 的 RNA 水平约为 5.6105GE/ug RNA,与野生型 FL-J6JFH1 相当,而 FL-J6JFH/J4NS5A 转染后第 5 天细胞内 RNA 水平仅为 4.3104GE/ug RNA。转染后第 8 天,免疫荧光检测 HCV 阳性细胞, 野生型 FL-J6JFH1 的阳性细胞数在细胞总数中的比例达到了 50%,而 FL-J6JFH/J4core 的值 约为 30%多,低于 core 置换前的野生型 FL-J6JFH1 株的水平。RNA 转染的细胞第 8 天阳