《伤寒论》附子汤不同剂型急性毒性试验——附子汤毒理学基础研究之一

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1、2 3 3F l u o 一3 A M 标记细胞内C a 2 + 及细胞内C a 2 +浓度测定：配置终浓度为5 肛M 1 5 p M 的f l u o 一3 A M工作液。室温孵育4 5 6 0 m i n 。上激光共聚焦显微镜测量。设置激发光波长为4 8 8 n m ，发射光波长为( 5 3 0 1 5 ) r i m ，p i n h o l e 为2 4 A i r y 。设置扫描方式( m o d e ) ：选择X Y t 方式进行扫描。每个视野取十几个或数十个细胞，每个组取1 5 个视野左右，使每个样品采集细胞数在1 0 0 个以上。计算机软件测定每个细胞的平均荧光强度，以空白组的

2、荧光强度为1 0 0 ( ) ，并进行统计学分析。3 讨论我们利用此实验平台观察了半夏泻心汤对胃肠起搏细胞的影响，结果显示：( 1 ) 半夏泻心汤药物血清能极显著提高I C C 膜电位的相对荧光值( P 0 0 1 ) ，提示半夏泻心汤药物血清能提高I C C 膜电位。对于属于兴奋性细胞的I C C 来说，提高其膜电位就能提高其兴奋性，使之更易产生自发性节律性S W ，并经由I C C 形成的网络传向平滑肌细胞，使平滑肌细胞在S W 的基础上产生动作电位，出现收缩，促进胃肠运动。( 2 ) 能极显著提高I C C 线粒体膜电位的相对荧光值( P 0 0 1 ) ，表明半夏泻心汤药物血清能提高I

3、 C C 线粒体膜电位，使I C C 线粒体磷脂含量及膜流动性升高，促进A T P 生长，抑制细胞色素C ( c y tC ) 的释放，灭活胱门蛋白酶( c a s p a s e s ) 等酶系，抑制细胞凋亡。( 3 ) 半夏泻心汤药物血清能极显著降低I C C 细胞内C a 抖浓度的相对荧光值( P o 0 1 ) ，提示半夏泻心汤药物血清能降低I C C - C a 2 + i ，从而通过抑制I C C 钙超载，一方面J T C M J u n e2 0 0 6 ，V 0 1 4 7 ，S u p p l e m e n t抑制细胞损伤和凋亡，一方面减少触发活动和折返，防治I C C 兴

4、奋节律失常，从而防治胃肠运动障碍。从以上结果我们得出结论，半夏泻心汤通过提高I C C 膜电位和线粒体膜电位，降低I C C C a 2 + i 以促进胃肠运动，防治胃肠运动障碍。胃肠动力疾病是目前研究的热点之一，随着胃肠动力的理论发展，对胃肠动力疾病的研究也逐渐深入，特别是中药复方对胃肠动力疾病的治疗，越来越受到关注。因此，在本次实验中，我们以半夏泻心汤为研究对象，通过观察其对胃肠起搏细胞的影响，旨在摸索出一套成熟可行的实验方法，建立起研究中药复方对胃肠起搏细胞调节作用的实验平台。以平台为基础，可以进一步对具有调节胃肠动力的中药复方进行深入研究，找出其作用靶点和机制，为中药复方的研究和开发奠

5、定科学实验基础。参考文献1K o hS D ，S a n d e r sK M ，W a r dS M S p o n t a n e o u se l e c t r i c a lr h y t h m i c i t yi nc u l t u r e di n t e r s t i t i a lc e l l so fC a j a lf r o mt h em u r i n es m a l li n t e s t i n e J o u r -n a lo fP h y s t o l o g y ，1 9 9 8 ，5 1 3 ( 1 ) ：2 0 3 2K a s t

6、e n F H I n t r o d u c t i o nt of l u o r e s c e n tp r o b e s ：p r o p e r t i e s ，h i s t o r ya n da p p l i c a t i o n s I n ：M a s o nW T e d F l u o r e s c e n ta n dl u m i n e s c e n tp r o b e so fb i o l o g i c a la c t i v i t y Ap r a c t i v a lg u i d et ot e c h n o l o g yf

7、o rq u a n t i t a t i v er e a lt i m ea n a l y s i s N e wY o r k ：A c a d e m i cP r e s s ，1 9 9 3 ：1 23 3 3 李楠，尹岭，苏振伦主编激光扫描共聚焦显微术北京：人民军医出版社，1 9 9 7 ：l3 4 崔晓兰，贺玉琢，高英杰中药药理研究的新思路中药血清药理学中国中医药科技，1 9 9 7 ，4 ( 4 ) ：2 3 9 2 5 0 *北京中医药大学( 1 0 0 0 2 9 )伤寒论附子汤不同剂型急性毒性试验附子汤毒理学基础研究之一李国英+韩涛刘持年郭炜。附子汤源于伤寒论，为仲

8、景温阳第一方，主治阳气虚衰，阴寒内盛之少阴寒化证。近年来，该方被广泛应用于临床各科多种疾病，冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管系统疾病，慢性胃炎、慢性肾功能不全、风湿性关节炎等消化系统、泌尿系统、免疫系统疾病，以及妇科的习惯性流产、儿科的d , J I 遗尿等疾病。但方中君药附子乃有毒之品，大大限制了附子汤及其类方的临床应用与研究开发。因而有必要对附子汤进行毒理学的基础试验研究，以确定其安全用药范围，探讨复方环境中药物配伍对附子毒性的影响机制，为临床合理应用附子汤及其类方提供可靠的依据。1实验材料1 1药材：附子、人参、白术、茯苓、白芍，均购自济南建联中药店，经山东中医大学中药鉴定教研室鉴定。1

9、 2 药物制备：附子汤水煎液制备：附子、人参、白芍、茯苓、白术，按照6 ：2 ：3 ：3 ：4 的比例投药，加水量为药材的6 倍，浸泡3 0 分钟，加热至沸，煎煮3 0 分钟，倾出药液，残渣再加入4 倍量水，煎煮3 0 分钟，合并两次煎液，过滤，浓缩。附子汤水煎醇沉液制备：取上述水煎浓缩液，在不断搅拌下将2 倍量9 5 的乙醇缓慢加入，置4 C 冰箱内静置2 4 小时，吸取上清液，充分回收乙醇，在6 5 中医杂志2 0 0 6 年6 月第4 7 卷增刊恒温水浴锅上浓缩成5 0 0 ( 以附子含量定浓度) 的附子汤水煎醇沉液供实验用。1 3 动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重( 2 0 2 ) g

10、 ，购自山东大学医学院实验动物中心，合格证号：S C X K( 鲁) 2 0 0 3 0 0 0 4 。2 实验方法2 1 附子汤水煎剂的急性毒性实验：预实验发现附子汤水提液的药物浓度达到l g m l ( 生药附子含量) 时，已是最大灌胃浓度、按0 4 m l 1 0 9 体重( 已是最大灌胃容积) 给小鼠灌胃给药时，小鼠仍存活，无死亡，急性毒性试验测不出L D 。，鉴于给药浓度及允许最大给药量的限制，附子汤水提液的急性毒性实验改做最大耐受量测定。取小鼠2 0 只，雌雄各半，禁食1 2 小时，不禁水后，以最大浓度l g 原药( 单纯以附子定量全方浓度，已是最大给药浓度) m l 浓度和0 4

11、 m l 1 0 9 体重的给药体积，1 日3 次( 间隔时间为4 小时) 灌胃给予小鼠，其剂量为1 2 0 9 k g 体重，之后连续观察7 日。2 2附子汤水煎醇沉剂的急性毒性：取体重( 2 0 2 )g 的昆明小鼠5 0 只，雌雄各半。依据改良的寇氏法测定L D 5 0 。在预试的基础上，按组间剂量比值1 ：0 7 分为5 组，每组1 0 只小鼠，禁食1 2 小时，自由饮水。之后将附子汤水提醇沉液以1 8 0 0 0 9 k g 、1 2 6 0 0 9 k g 、8 8 2 0 9 k g 、6 1 7 4 9 k g 、4 3 2 2 9 k g5 个不同剂量按0 2 m l k g

12、 体重的给药体积灌胃给予各组小鼠，连续观察7 天，记录小鼠的中毒反应，死亡数和死亡情况。另外取1 0 只小鼠灌以等体积蒸馏水作空白对照。3实验结果3 1附子汤水煎剂急性毒性实验，J 、鼠末次灌胃给药后0 5 小时内，可见动物活动减少，摄水量减少，倦卧欲睡，上述症状多在6 小时内缓解，并渐恢复正常；在给药后4 6 小时，部分小鼠出现轻微腹泻，2 天后恢复正常。7 日观察时间内，小鼠的日常行为及饮食、饮水无异常，活动自如，体重也有所增长。按最高浓度1 0 0 及小鼠能承受的最大灌胃容量( 0 4 m l 1 0 9 体重) 计算小鼠最大给药量为1 2 0 9 k g 体重，说明小鼠的最大耐受量大于

13、1 2 0 9 k g 体重。3 2附子汤水煎醇沉剂急性毒性实验：染毒约1 5 分钟后，高剂量组实验动物可出现精神萎糜，自发活动减少，步履不稳；3 0 分钟后，眼内分泌物亢进，反应迟钝；4 0 分钟2 小时，呼吸频率及心率减慢，对外界刺激基本无反应。中低剂量组实验动物症状轻于高科量组。依据改良寇氏法公式L D 。一l g - - 1 X m - - i ( 2 _ 5 P 一0 5 ) 一1 0 9 9 2 9 k g 体重L D s 。的9 5 可信限= l g 一1 ( X 5 01 9 6 S x 5 0 ) 一1 6 2 0 5 , - - 4 2 7 4 4 9 k g 体重 4 讨

14、论本研究实验结果表明，附子汤水煎剂的毒性作用明显低于水煎醇沉剂，提示药物提取方式不同，成分溶出率有别，则药物作用于机体引发的效应迥异。导致此种现象出现可能存在的原因，大致有以下几种：首先，附子的毒性成分主要是双酯型二萜类生物碱：如乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等，此类生物碱毒性很大，经水解成为毒性较小的单酯类生物碱。此类生物碱可溶于醇类溶剂，醇沉过程增加了乌头碱的溶出率，且临床实践证明乙醇能够促进乌头碱的吸收，因而加强了附子的毒性。其次，醇沉提取工艺的运用，沉淀了一部分溶于水、不溶于或难溶子有机溶剂药物成分，主要是具有一定程度极性的蛋白质、氨基酸、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等，这些成分对于减低附

15、子所含双酯型二萜类生物碱的毒性可能起关键作用，不容忽视。再者，乙醇的加入，使某些药物成分的结构发生了改变，进而影响了药物之间的相互作用，减低了药物配伍的解毒作用，抑或是产生了新的毒性物质，进而加剧了毒性作用。本课题初步研究了昆明小鼠对附子汤不同剂型的急性毒性反应。因人与实验动物对药物反应的种属差异，决定了附子汤毒理学基础研究还需要进行不同种属动物的急性毒性试验，以及蓄积毒性和长期毒性试验，以完善经方附子汤的毒理学理论，便于临床应用。*山东中医药大学( 2 5 0 0 1 4 )黄芩苷对四氯化碳致大鼠肝损伤的保护作用谭常青1 庄锡伟2黄芩为常用中药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，其含有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等有效成分。药理研究表明黄芩苷是黄芩主要有效成分。具有抗菌、抗病毒、促进细胞免疫、抗致癌、降压和镇静等作用。现将其对肝损伤的保护作用研究结果报道如下。