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1、未通过药敏试验前或无药敏试验条件，需根据用药历史和本社区的情况选择可能敏感药物组成新方案。 3 4 2 对耐一线药或耐多药的患者，应采用未曾用过的二线药或可能的敏感药。 3 4 3 强调用药个体化，对长期采用所制定的化疗方案疗效不佳时，应开展血药浓度监测，及时调整用 药剂量，以提高疗效，或加用免疫调节剂，增强患者抵抗力。 3 4 4 尚需考虑患者接受能力即每次注射药量、疼痛程度、口服片剂大小、味道能否适应、耐受性、潜 在毒性等，并密切注意和及时处理药物毒副反应。替米沙坦在C a c o 一2 细胞模型中的体外转运研究 沈杰焦正李中东施孝金童如镜钟明康( 1 上海市华东医院药剂科，上海2 0 0
2、 0 4 0 ； 2 复旦大学附属华山医院药剂科，上海2 0 0 0 4 0 ) 摘要：目的研究替米沙坦( T e h n i s a r t a n ，T M S ) 在C a c o - 2 细胞中的跨膜转运特征。方法采用体外 培养的人小肠上皮细胞C a c o - 2 模型对T M S 的跨膜转运进行研究。考察了浓度、p H 、P 一糖蛋白( P g l y p r o t e i n ，P - g p ) 抑制剂对T M S 跨膜转运的影响。结果T M S 在C a c o - 2 细胞中的转运存在外排作用， 并且外排作用随着浓度的增加趋于饱和；另外T M S 的吸收转运随p H 值的
3、增加而减少。加入P 一糖蛋白 抑制剂环孢素和乙胺碘呋酮后，P 哪j 。从3 5 分别下降到1 2 和0 9 ，加入前后有极显著性差异( P 9 9 ) 由四川宝光制药有限公司提供；萘普生对照品( 内标，纯度9 9 8 ) 由上海市药检所提供；环孢素A ( 纯度：9 9 ) 由中国药品生物制品检定所提供；乙胺碘呋酮( 纯度：9 9 ) 由上海华东医院提供；高糖型D M E M 培养基、灭活胎牛血清、H a n k S 缓冲溶液、H E P E S ( _ 2 一 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e 一_ 2 一e t h a n e s u l
4、 f o n i ca c i d ) 购自奥地利P A Al a b o r a t o r yG m b H 公司；胰酶一 E D T A 消化液、非必需氨基酸、荧光黄( L u c i f e ry e l l o w ) 购自美国S i g m a A l d r i c h 公司；青霉素、链霉 素购自上海先锋制药有限公司；乙腈( 色谱纯) 购自美国B u r d i c k & J a c k s o n 公司；其余试剂( 分析纯) 购自中国医药集团上海化学试剂公司；细胞培养用消耗品购自美国C o r n i n g 公司。 1 2 仪器 H P L C 系统( 日本岛津公司，S h
5、 i m a d z u ) ：L C - 1 0 A D 泵、R F - 1 0 A X L 荧光检测器、S I L - 1 0 A 自动 进样器、工作站C l a s s - L C l 0 & C B M 1 0 A( V e m i o n1 6 3 ，1 9 9 6 ) ；M i l l i c e l l - E R S 跨膜电阻仪、M i l l i c e l l 膜由美国M i l l i p o r e 公司提供。2方法2 1细胞系来源与培养1 C a c o - 2 细胞系购自中科院上海细胞所细胞库。细胞培养液为高糖型D M E M ，含有0 1 5 葡萄糖，0 2m o
6、 l LL 一谷氨酰胺，1 0 胎牛血清，1 0m m o l LH E P E S ，1 非必须氨基酸，0 3 碳酸氢钠，1 0 0U m L 青霉素，1 0 0U m L 链霉素。细胞培养于D M E M 培养液中，接种于T - 7 5 组织培养曲颈瓶中，置于3 7 “C 培养箱中，通入5 C 0 2 ( 相对湿度9 0 ) 。培养液2 - 3d 更换一次，每5d 按l ：】0 传代。细胞 按5 0 ，0 0 0 个c m 2 接种到M i l l i c e l l 膜上，接种后每2d 换液1 次，1w k 后每天换液，培养至2 ld 。跨膜 电阻 3 2 0Q c m _ 1 和荧光黄
7、2h 通透量小于1 的膜用于药物转运实验。2 2T M S 溶液的配制 精密称定T M S1 0 0 0 0m g 于1 0m L 容量瓶中，加D M S O 溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。实验前 用相应p H 值的H a n k S 缓冲液稀释至所需浓度，其中D M S O 最终浓度低于1 。2 3T M S 细胞转运实验2 3 1不同浓度T M S 吸收( A P - B L ) 和分泌( B L A P ) 转运研究用p H 值7 4H a n k s 溶液配制成 浓度为2 ，1 0 ，1 0 0ug m L 的T M S 溶液。取生长2 1d 符合转运条件且细胞生长良好的M i l l
8、 i c e l l 膜，弃 去细胞培养液，然后用3 7 H a n k S 液冲洗单层细胞表面3 次。对于吸收转运：将不同浓度T M S 溶液1 5m L 加到A P 侧作为供给池，同时在B L 侧加入p H7 4 的H a n k S 液2 0m L 作为接收池；对于 分泌转运：将不同浓度的T M S 溶液2 0m L 分别加到B L 侧作为供给池，同时在A P 侧加入p H7 4 的 H a n k S 液1 5m L 作为接收池；将M i l l i p o r e 膜置转速为5 0r m i n 的3 7 恒温水槽中，分别在1 5 ，3 0 ，4 5 ，6 0 ，9 0 ，12 0r
9、 a i n 吸取接受液1 0m L ，同时补加3 7 p H7 4 的H a n k S 液1 0m L ，试验重复3次。2 3 2p H 对T M S 吸收转运的影响用p H 值6 0 ，6 5 ，7 4 H a n k S 溶液分别配制成浓度为1 0 “g m L 的T M S 溶液1 5m L 加到A P 侧作为供给池，同时在B L 侧加入p H7 4 的H a n k S 液2m L 作为接收 池，以“2 3 1 ”项下考察p H 对T M S 吸收转运的影响。2 3 3P - g p 抑制剂对T M S 吸收和分泌转运的影响将含1 0um o l L 环孢素( C y c l o
10、s p o r i n ，C yA ) 或1 0um o l L 乙胺碘呋1 5 N ( a m i o d e r o n e ，A M D ) 的H a n k S 溶液分别加入供给池和接受池中，3 7 共浴 2 0m i n 。弃去培养液，用p H 值7 4 H a n k S 溶液配制成各含1 0 “m o l LC yA 或含1 0 m o l LA M D 的2Hg m L T M S 溶液。以“2 3 1 ”项下考察P - g p 抑制剂对T M S 吸收和分泌转运的影响。 2 4 样品分析4 色谱条件：K r o m a s i lC 8 柱( 1 5 0m m x 4 6m
11、m ，5um ) ，柱温：2 5 ，流动相：乙腈一0 0 2m o l L磷酸二氢钾溶液( 5 0 ：5 0 ，v v ) ，流速：1 2m L m i n ，荧光激发波长3 0 5n m ，发射波长3 6 5n m 。 样品预处理：取转运样品5 0 0uL ，加入内标工作液( 2 5 “g m L 萘普生溶液) 2 5uL ，涡旋混合lm i n ，高速离心1 0r a i n ( 1 0 ，0 0 0g ) ，取上清液2 0 “L 进样。 建立标准曲线，计算质控样品的准确度和精密度。 2 5 数据分析表观通透系数值P 。p 的计算：P 。= ( d Q d t ) ( A * C o )
12、P 。代表药物转运能力的大小。A Q 为t 时间内的药物转运量，A 为表面积( 此试验中为4 2c m 二) ，C o 为供给池中T M S 的初始浓度。P 。p p 单位为距离时间( c m s e c ) 。 外排率P r a t 沁的计算：P r a t i o = P 。D 咖。P 。p 阳b P r a t i 。代表药物净外排的能力的大小，同时可以预测外排作用引起的药物口服吸收减弱的程度。P 。m n 。2 1 2为分泌表观通透系数，P 。为吸收表观通透系数。 各组间差异显著性判定采用t 检验。 3 结果3 1T M S 分析方法的验证取空白H a n k S 溶液进样2 0 ”L
13、 ，其对样品的测定无干扰，内标萘普生和T M S 的典型色谱保留时间 分别为4 0 9r a i n 和5 4 5m i n ，整个色谱分析过程时间为6m i n 。 取T M S 标准曲线2 0 ，1 0 0 ，4 0 0 ，8 0 0 ，1 5 0 0 ，2 0 0 0n g m L 系列样品，样品按“2 4 2 ”项预处理后 进行分析，以对照品与内标峰面积比P A R 和T M S 的浓度C ( n g m L ) 作加权( 1 C 2 ) 线性回归，得标准 曲线回归方程为： P A R = 0 0 0 2 0 6C + 3 3 3 4 1 0 3 ，= 0 9 9 91 线性范围为2
14、0 2 0 0 0n g m L ，T M S 最低定量浓度为2 0n g m L 。 浓度为5 0 ，1 0 0 0 ，1 6 0 0n g m L 三种T M S 质控样品方法回收率1 0 0 7 - 1 0 5 0 ，日内、日间精 密度均小于9 。T M S 在缓冲液中至少保持1m 稳定。3 2T M S 吸收和分泌转运研究3 2 1不同浓度对T M S 转运的影响2 ，1 0 ，1 0 0 “g m L 三种T M S 溶液在C a c o - 2 细胞模型中吸收转 运和分泌转运的结果见图1 。结果表明，T M S 吸收转运P 。m 。b 较低，且不随供给池中T M S 浓度变化而变
15、化；另一方面，T M S 分泌转运要快于吸收转运，T M S 分泌转运P 。mb 。随T M S 浓度增高而降低。在低浓 度时，两者比值较高。随着浓度的增加，比值呈下降趋势。Pr a t i 。由2ug m L 时的3 5 下降到1 0 0 “g m L 时的2 0 。F i g1E f f e c to fc o n c e n t r a t i o no nt h ePo fT M Sa c r o s sC a c o - 2c e l lm o n o l a y e r sn = - 3 )l、(13 2 2p H 对T M S 吸收转运的影响在p H 为6 0 ，6 5 ，7 4
16、 条件下，p H6 0 和6 5 条件 下T M S 的2h 累积透过量和表观通透系数P 。分别是p H7 4 条件的1 8 倍和1 4 倍，结 果有极显著性差异( P 0 0 1 ) 。结果见表1 。由此可见T M S 的转运明显受介质p H 的影响， p H 值越低，累积透过量和表观通透系数P 越大。表1p 条件对替米沙坦( 1 0ug m L ) 表观通透系数P 。和累积透过量的影响( n = - 3 ) T a b1E f f e c to fp Ho nt h et r a n s e p i t h e l i a lt r a n s p o r tf l u xa n dPa p po fT M S ( 1 0 “g
