血红蛋白的提取和分离预习学案

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1、第 1 页 共 4 页5.35.3 血红蛋白的提取和分离导学案血红蛋白的提取和分离导学案班级班级 姓名姓名 【导学诱思导学诱思】 思考思考 1 1：分离生物大分子的基本思路是什么？：分离生物大分子的基本思路是什么？ 思考思考 2 2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？：蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 思考思考 3 3： 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 思考思考 4 4：人们用鸡的红细胞提取：人们用鸡的红细胞提取 DNADNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？，用人的红细胞提取血红蛋白的原

2、因是什么？一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质 的有效方法。 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白质容易进入凝胶 内部的通道，路程 ，移动速度 ，而 的蛋 白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3、具体过程：A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。 B.（1） 混合物上柱； （2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白 质

3、被排阻于凝胶颗粒之外； （3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。 （4） 不同的蛋白质分子完全分开； （5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行 进中。 缓冲溶液：缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH 发生明显变化的作用叫做 缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持 PH 基本不 变。 3、缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制 得 使用的缓冲液。凝胶颗粒相对分子质 量较小的蛋 白质相对分子质 量较大的蛋 白质（1）（2）（3）（4）（

4、5 ）BA多孔板第 2 页 共 4 页思考：说出人体血液中缓冲对？思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？电泳：电泳： 1、概念：指 发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 3、分类： 电泳 电泳。测定（测定（ 蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠）通常

5、用十二烷基硫酸钠 （SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的 多少以及分子的大小等因素。 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS 能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质 复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果 只是 。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质SDS 复合物，SDS 所带负电荷的 量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定

6、1.1.样品处理样品处理(1)红细胞的洗涤 目的：去除 方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分 离的效果） ，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 再加入用 的 质量分数为 0.9的氯化钠溶液洗涤 低速离心（低速短时间） 重复 4、5 步骤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离 纯化，不可洗涤次数过少。 (2)血红蛋白的释放 加 到 体积，再加 40体积的 溶解细胞膜） ，置于 上充分搅拌 10 分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/m

7、in 的速度离心 10 min ，试管中的溶 液分为 4 层: 第 1 层（最上层）： 甲苯层 第 2 层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体 第 3 层（中下层）： 的水溶液层， 的液体 第 4 层（最下层）：其它杂质 的沉淀层 (4)透析 2.2.凝胶色谱制作凝胶色谱制作阴极阳极加入待分离 的样品带电性质、分子大小和形 状的不同，使分子迁移速 度不同分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图第 3 页 共 4 页1）凝胶色谱柱的制作 取长 40 厘米，内径 1.6 厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用 100 目尼龙纱包好。

8、 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在 0.5ml 的 头部切下 长的一段，插入 橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一 端。 d、色谱柱下端用移液头部做 ，连接一细的 ，并用螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集 的收集器内 顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： 。 （2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 固

9、定：将色谱柱处置固定在支架上 装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使 凝胶填装均匀。 洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用 300ml 的 20mmol/l 的磷酸缓冲液（pH 为 7.0）充分 12 小时。 3）样品加入与洗脱 （1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐， 关闭出口 （2）加透析样品 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用 将 1ml 的样品加到色谱柱的 样品渗入凝胶床： 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一 试管连续收集 思考：与其它真核细胞相比，红

10、细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤 红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的 杂质，即（ ） ；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ） ； 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ） 。 3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断

11、 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 电泳方法步骤：电泳方法步骤： 1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备第 4 页 共 4 页3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上 5)加样：按顺序加样，加样量通常为 1025L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进 行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品 6)电泳 7）剥胶 8）染色 9)脱色 10)观察结果 三三 实验结果分析与评价实验结果分析与评价 观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外， 离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的 提取纯度。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋