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1、江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）第 1 页 生物技术及应用论文生物技术及应用论文 专专 业业 生物技术及应用生物技术及应用 不同浓度 6-BA 对菊花出芽的影响第 2 页 不同浓度 6-BA 对菊花出芽的影响摘要：为了探讨菊花组培快繁技术中不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）对芽诱导的影 响。以菊花嫩茎段为材料, 在MS培养基中分别添加0.0 (对照)、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L的 6-BA,观察菊花的出芽诱导的情况。结果表明最佳出芽诱导培养基为MS+6-BA 4.0mg/L + NAA0.2mg/ L。另外Vc对防止外植体褐变有明显作用。 关键词：快繁技术;组织培养;菊花
2、；褐变Effects of 6-BA with Different Concentrations on the budding of ChrysanthemumAbstract: In order to discuss the chrysanthemum group to cultivate in the quick numerous technology the different density 6- animal pen amino adenine (6-BA) pair of bud induction influence. Take the chrysanthemum tender
3、stem section as the material, increases 0.0 separately in the MS culture medium(comparison),1.0,2.0,3.0,4.0mg/L 6-BA,the observation chrysanthemums bud induction situation. The result indicated the best bud induction culture medium is MS + 6-BA 4.0mg/L + NAA0.2mg/L .Moreover Vc to outside prevented
4、plants the body turning brown to have the obvious function. Key words: the quick numerous technology；tissue culture；chrysanthemum；Browning江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）第 3 页 目目 录录引言 91 材料和方法 91.1 实验材料和用具91.2 培养条件91.3 培养方法 102 组织培养中出现的问题与处理（包括褐变、污染） 112.1 褐变 112.2 污染113 结果与分析 124 小结与讨论 13参考文献 13致谢 14不同浓度 6-BA 对菊
5、花出芽的影响第 4 页 引言引言菊花菊花 1 (Chrysanthemum)为菊科菊属的多年生宿根草本植物或半灌木,又称“菊”、“秋菊”、“黄花”。株高 20200cm，通常 3090。茎色嫩绿或褐色，除悬崖菊外多为直立分枝，基部半木质化。单叶互生，卵圆至长圆形，边缘有缺刻及锯齿。头状花序顶生或腋生，一朵或数朵簇生。舌状花为雌花，筒状花为两性花。舌状花分为下、匙、管、畸四类，色彩丰富，有红、黄、白、墨、紫、绿、橙、粉、棕、雪青、淡绿等。筒状花发展成为具各种色彩的“托桂瓣“，花色有红、黄、白、紫、绿、粉红、复色、间色等色系。花序大小和形状各有不同，有单瓣，有重瓣；有扁形，有球形；有长絮，有短絮，
6、有平絮和卷絮；有空心和实心；有挺直的和下垂的，式样繁多，品种复杂。在我国已有 3 000 多年的栽培历史,现有 3 000 多个栽培品种；并已成为世界性的重要花卉,其产销量居四大切花之首。目前,菊花的主要繁殖方法2有扦插繁殖、分株繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖等,这些方法均存在一定程度的缺点与不足,主要表现为繁殖速度不快、病虫害发生频率高、易受季节变化影响等等,利用组织培养技术进行菊花的快速繁殖,则可有效解决上述问题与矛盾,已越来越成为菊花繁殖的重要方法与手段,在菊花种苗生产上加以推广应用。本研究以菊花的嫩茎为外植体,利用不同浓度6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 和一定浓度的-萘乙酸(NAA) 为外源激
7、素,进行菊花的组织培养技术研究,旨在研究不同浓度6-BA对菊花出芽的影响。,结果报告如下：1 材料和方法1.1 实验材料和用具(1)材料观赏性菊花嫩茎(2)器材与用具超净工作台、 解剖刀、 长柄镊子、 架台、无菌滤纸、 酒精灯、火柴、 标签、 铅笔、棉球、废液缸、垃圾袋、皮筋、精密 pH 试纸（5.47.0） 、玻璃三角瓶（150ml） 、封口膜、培养皿。(3)药品与试剂MS培养基母液、激素(生长素 、细胞分裂素等)母液、有机物（琼脂、蔗糖）、无菌水、0.1 %升汞、 70 %、75%酒精、0.1MNaOH。1.2 培养条件江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）第 5 页 (1) 温度适宜的温度
8、范围为 2426。(2) 光照光周期：以 12 16h/ d 为宜。在愈伤诱导期进行适量的暗培养,有促进愈伤形成的作用。光照强度：范围为 1000 4000lx, 较多选择 1500 2000lx。4000 5000lx 的光照使试管苗的分化增殖倍数提高, 但对生根则相反。(3) 光质白色光一般能满足生长需要。本实验采用一般的日光灯。1.3 培养方法31、接种室的灭菌在实验的前一天,将接种室用高锰酸钾和甲醛熏蒸进行灭菌消毒。2、超净工作台及器械消毒启动超净工作台,操作之前用 70 %的酒精擦台面。将操作用刀、 镊子、 剪子等用具在酒精灯下用火灼烧到变红,冷却待用。 3、培养基配制 基本培养基为
9、 MS 由 6 种母液按比例配成，附加蔗糖 3%，琼脂 0.8%丛生芽诱导培养基：MS + 6-BA （0.0、1.0 、2.0、 3.0 、4.0）mg/ L + NAA0.2mg/ L NAA（奈乙酸）的浓度 0.2 mg/ L 是根据李秋杰,陈春燕,张吉3等人的研究数据得出的，其中 5 种 6-BA 浓度不同的培养基各配 20 瓶。生根培养基：1/ 2MS + IBA 0.1 mg/ L IBA（吲哚丁酸）的浓度 0.1 mg/ L得出依据同 NAA。共配 100 瓶。培养基装瓶灭菌：将已配好的培养基,调节 pH 值为 5.8。趁热分装在培养瓶中(每瓶 3550mL)并注明培养基的成分与
10、作用 。用专用透性膜封好后放入高压灭菌锅中灭菌、待用。 4、材料选取 选取在脱毒实验中成功移栽上盆而且长势健壮的植株作为实验材料,选取茎作为实验材料。5、材料灭菌 选取生长健壮的嫩茎洗去表面泥土 ,在超净工作台 ,用 75 %酒精处理 2030 秒 ,再用无菌水冲洗 35 次 ,转入 0.1 %升汞溶液浸泡 810 分钟 ,再用无菌水冲洗 46 次 ,用滤纸吸干水分。6、接种（1） 在无菌条件下将其切成 2 厘米左右带有腋芽的小段。不同浓度 6-BA 对菊花出芽的影响第 6 页 （2） 用镊子夹取切好的外植体材料,然后按极性方向直立迅速接种到锥形瓶的培养基中,深约 23 mm,注意培养瓶口始终
11、在火焰下方,尽量使切口接触培养基。（3） 每个锥形瓶可接种 3 块外植体。（4） 接种时锥形瓶应保持倾斜,接种后要迅速将瓶口在酒精灯上转动灼烧一遍进行消毒,然后迅速盖上专用透性膜封好。（5） 最后在瓶壁上贴上标签,注明接种材料的名称、 编号和接种日期。（6） 接种完成后即转入培养室进行初代培养 ,培养温度 2228 ,光强10004000 Lx。7、愈伤组织及丛生芽诱导外植体接种到培养基上 7 天左右，茎段开始变粗，并在其切口周围出现少量嫩绿色、质地紧密的愈伤组织，同时腋芽开始萌动展开。经过 105 天的培养后，腋芽伸长，并形成丛生芽，逐渐长成苗丛。此时记录出芽瓶数并比较不同浓度 6-BA 下
12、的出芽瓶数。8、根的诱导当丛生芽长成的小苗达 23 厘米时，将其切下转入生根培养基，大约一周左右的培养，小苗开始生根。2 组织培养中出现的问题与处理（包括褐变、污染）2.1 褐变外植体的褐变是组织培养过程中的主要障碍。目前一般认为影响褐变的因素主要有外植体材料、培养基和培养条件。为了防止褐变的发生，主要可以从外植体和培养条件、进行细胞筛选和材料的预处理、抑制剂或者吸附剂的加入等方面入手8-11。主要方法有：（1）在培养基中加入吸附剂可以抑制褐变。（2）组织培养过程中可以在培养基加入抗氧化剂和其他抑制剂来抑制外植体的酶促褐变。（3）在愈伤组织诱导中，接种前先用 100 mg/ L Vc（L-抗坏
13、血酸） 浸泡外植体 1 h ,可有效地控制褐变现象。（4）褐变程度与外植体的伤害程度有关，在切取材料时，应尽量减小伤口面积，伤口剪切得尽可能平滑。我们采用方法（3）即在接种前先用 100 mg/ L Vc 浸泡外植体 1 h 进行重新试验。并记录了 2 次实验结果。2.2 污染江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）第 7 页 污染一般分为真菌性污染和细菌性污染 ,其来源可分成 3 大类:材料带菌,接种污染,培养过程感染 。细菌污染主要 由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的 污染，从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展
14、，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在24 天表现，内生菌则会超过4 天，并且菌的种类也相对单一。而真菌污染主要有曲霉，毛霉，青霉，根霉等。根据研究资料12得出染菌的原因有接种室空气中真菌含量高，超净工作台、操作所需的机械未消毒干净，接种时操作人员的操作失误等3 结果与分析由于培养过程中出现异常情况，我们通过查阅资料解决后再次试验，记录统计后得出下表：表表 1 1：VcVc 对外植体褐变的影响对外植体褐变的影响培养基接种瓶数/瓶没用 Vc 前 褐变瓶数/瓶用了 Vc 后 褐变瓶数/瓶MS+6-BA0.0mg/L+NAA0.2mg/L20114MS+6-BA1.0mg/L+NA
15、A0.2mg/L2072MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L2062MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L2062MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L2051表表 2：不同浓度：不同浓度 6-BA6-BA 培养基对菊花出芽的影响培养基对菊花出芽的影响培养基6-BA 与 NAA的浓度配比接种芽数/个出芽数目/个出芽率/%MS+6-BA0.0mg/L+NAA0.2mg/L020*358.27%MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L1：220*32643.33MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L1：120*33761.67不同浓度 6-BA 对菊花出芽的影响第 8 页 MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L1.5:120*34371.67MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L2:120*35083.33表 1 表明：Vc 对外植体的褐变有明显的抑制作用，这与崔唐兵，郭勇，张长远的研究结果10相
