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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 文库构建的主要步骤文库构建的主要步骤一、试剂与培基(一)YPD pH5.81%酵母提取物2%蛋白胨2%D-葡萄糖1.5%2%琼脂高压灭菌。(二)SOS pH5.81mol/L 山梨醇6.5mmol/LCaCl20.25%酵母提取物0.5%蛋白胨20g/ml 尿氨酸色氨酸高压灭菌。(三)SCEM pH5.81mol/L 山梨醇10mmol/LEDTA，pH8.00.1mol/L 柠檬酸钠高压灭菌后加入 -巯基乙醇至终浓度 30mmol/L。(四)SORB pH5.8KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 山梨醇3%D-葡萄糖0.67%酵母氮碱(不含氨基
2、酸)1.5%2%琼脂高压灭菌。(五)STC1mol/L 山梨醇10mmol/LTris-HCl，pH8.010mmol/LCaCl2高压灭菌。(六)TOP1mol/L 山梨醇0.67%酵母氮碱2%D-葡萄糖1%琼脂pH5.8，高压灭菌，使用前加入所需氨基酸。(七)PEG20%PEG800010mmol/LTris-HCl，pH8.010mmol/LCaCl2过滤灭菌。(八)SDKKME-专业医学搜索引擎 http:/ Sigma# 使用终浓度(g/ml)Ade 9795 10Arg 3909 40His 9511 20Ile 7383 60Leu 1512 60Lys 1262 50Met 3
3、893 20Phe 5030 50Thr 1645 200Trp 0271 40Tyr 1020 50(十)Zymolase20-T(SeikagakuKogyo120491)1000U/ml 溶于双蒸水中，过滤灭菌，4贮存。干粉-20贮存，溶液应尽量新鲜配制。(十一)Lyticase 1000U/ml 溶于双蒸水中，过滤灭菌，4贮存。干粉-20贮存，溶液应尽量新鲜配制。(十二)Agarase(Calblochem121814) 2000U/ml 溶于双蒸水，加50%甘油，-20存放。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 40g/ml 溶于 TE。二、外源基因组大片段 DNA 的制备(一)
4、低融点琼脂糖凝胶块包埋法制备高分子量 DNA，2106 细胞/块。详见本篇第 13 章第 10 节。(二)灭活蛋白酶 K 限制酶酶解之前，DNA 胶块在含有 PMSF的 TE 中 50保温 15min，换液重复一次，以灭活胶块中的蛋白酶K。再用大量的 TE 充分漂洗 3 次，每次 30min，除去 PMSF。(三)基因组 DNA 部分酶解 通过应用不同浓度的 Mg+控制酶解的程度，经脉冲场电泳确定。1.DNA 胶块在 50 倍体积的相应 1缓冲液(不含 Mg+)中 0平衡 3 次，每次 30min。2.将胶块置等体积的 1缓冲液中，加酶(EcoR)至终浓度5U/gDNA，4酶解 1h。3.按终
5、浓度 0.011.00mmol/L 浓度梯度加入 100mmol/LMgCl 溶液，立即将管置 37，保温 1h。4.吸除缓冲液终止反应，加入大量的冷 TE(pH10.5)。(四)基因组 DNA 完全酶解 用来浸泡的缓冲液含 Mg+，加酶量为终浓度 710U/mgDNA，37酶解 3h。其余步骤同部分酶解。(五)PFGE 分离所需大片段 DNA(可省)。三、YAC 载体的制备(一)按一般质粒制备法扩增、提取、纯化载体 pYAC4DNA。(二)用 BamH完全酶切载体 DNA，电泳分离提纯载体臂，然KKME-专业医学搜索引擎 http:/ EcoR酶解打开插入位置(可同时进行双酶解或分别进行)，
6、经酚、氯仿抽提纯化。(三)用 CIP0.030.06u/gDNA 处载体，蛋白酶 K 消化、酚氯仿抽提灭活 CIP。通过连接反应检验脱磷效果。四、连接(一)将 1ml 包埋插入片段 DNA 的 LMP 琼脂块置 50ml 双蒸水中浸泡 2 次，每次 30min，再用 1连接缓冲液浸泡 2 次，每次30min。(二)吸去浸泡液加入等重量的载体 DNA(载体与插入片段的分子比为 401)，将试管置 68水浴将琼脂胶块融化，转入 37水浴。(三)将 37预热的含 4000UT4 连接酶的 1连接缓冲液沿试管壁加入融化的胶中，缓缓混匀。(四)置 37连接 2h，再置室温(25)过夜。五、连接片段的纯化
7、和回收(一)脉冲场电泳分离1.用 0.5TBE 制备 1%LMP 琼脂 PFGE 凝胶。2.将连接反应体系于 68水浴融化，冷却至 37，用口径大于4mm 的吸头将连接反应物加入 PFGE 胶的样品池，待固化后移入电泳槽。3.设置脉冲条件：电压 160V，脉冲时间 30s50s，0.5TBE 缓冲液，电泳 18h。4.EB 染色，紫外灯下快速观察标记所需回收的连接片段(长时间KKME-专业医学搜索引擎 http:/ DNA 断裂)。5.胶块用 10mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，30mmol/LNaCl 浸泡 4 次每次30min，4保存备用。(二)琼脂糖酶消化
8、琼脂 转化前 2h 进行。1.回收胶块在 10ml 试管中用 30mmol/LNaCl 平衡 3 次，每次30min。2.于 68水浴中 5min 融化胶块。3.置融化的胶液于 37，按 4U/500l 琼脂的比例加入琼脂糖酶(agarase)，37保温 2h。4.置室温或 02min，反应混合物应呈现均一液态。六、酵母原生质转化(一)酵母原生质制备1.接种酵母菌 AB1380 于 200mlYPD 培养基中，30摇床剧烈摇动，培养菌液至半对数生长期(OD660 读数为 2，菌密度为1.8107/OD)。2.900g 离心收集菌沉淀，用双蒸水洗涤菌团 2 次、1mol/L 山梨醇洗 1 次，悬
9、浮于 5mlSCEM 液中，将菌液分成 4 份，每份约含菌1.2109 个。3.每份菌液加入等体积新鲜配制的 10U/mlLyticase1000U，30水浴中 2030min，中间轻轻摇动数次，酶解去除酵母菌细胞壁。也可用 Zymolase20-T20U30处理 1015min。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 离心收集沉淀，用 10ml1mol/L 山梨醇洗涤 1 次，再加入10ml 含山梨醇的 YPD 溶液，30复苏 30min。5.加入 5mlSTC，混匀，500g 离心，沉淀用 10mlSTC 洗 1 次，再悬浮于 5mlSTC 中。6.镜检去壁效果，经过以上去壁处理的酵母菌
10、在 STC 中仍能保持完整的细胞形态，加入 10 倍体积的双蒸水后，菌体将因低渗而崩解。此检验将说明制备的酵母原生质体合格，可用于转化。(二)原生质体的转化1.取 0.5mg 经琼脂糖酶处理过的已连接的 DNA(约 450l)，加0.3ml2mol/L 山梨醇，小心混匀，分装至 10ml 试管中，每管 15l，共 50 管。2.每管加入 100l 酵母原生质体，轻轻混匀，室温放置10min。3.各加 1mlPEG8000 小心混匀，置室温 10min，500g 离心 5min收集酵母细胞。此时转化的酵母细胞很松地贴附于管底，小心地吸去上清。4.加入 150lSOS 液，混匀，30孵育 45min。5.每管加入 3ml40预热的 TOP 琼脂(不含尿苷)，轻轻混摇后铺在 SORB(缺尿苷)固体培基上，置 30培养。6.转化的酵母菌落约在 34 天后出现。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ http:/
