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1、SARS 病毒单抗体的制备细胞工程 细胞工程目的探讨制备和鉴定 SARS 冠状病毒 N 蛋白单克隆抗体快速 免疫方法，为人类健康保驾护航！程心诚细胞工程之细胞工程之 SARSSARS 单抗体的研究制备单抗体的研究制备信息关键字：信息关键字：SARSSARS 冠状病毒冠状病毒 单克隆抗体单克隆抗体 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 筛选方法筛选方法方法：方法：用基因重组 SARS 冠状病毒 N 蛋白和免疫 2 周的 BALB/c 小鼠制备,并采用 ELISA 间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定.结果筛选出 4 株抗 SARS 冠状病毒 N 蛋白单抗体杂交瘤细胞株,ELISA 间接法和免疫荧光证实这组单
2、克隆抗体仅与 SARS 冠状病毒特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG 亚类鉴定 2 株为 IgG1,另 2 株分别 IgG2a 和 IgG2b.2株抗体亲和常数分别为 4.1410-9M 和 3.1910-9M.结论获得特异性针对 SARS 冠状病毒的单克隆抗体,为 SARS 的早期诊断、蛋白组学和发病机制的研究奠定了基础. .制备流程图：制备流程图： 抗原接种抗原接种皮下接种接种对象：目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以 Balb/c 小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来。Balb/c 系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以
3、 812 周龄为宜。抗原接种B 细胞获取纯化、检测等杂交瘤细胞细胞融合与筛选抗体制备瘤细胞复苏细胞培养注射 SARS 病毒 N 蛋白一般而言，抗原的纯度不很重要，只要足够引起免疫反应即可，特别是免疫原性较强的抗原。 效应效应 B B 淋巴细胞制备淋巴细胞制备注：注：以免疫三天后取样，此时分离的淋巴细胞最适于后续的融合。以免疫三天后取样，此时分离的淋巴细胞最适于后续的融合。(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠，拉颈或用 CO2 处死小白鼠。(2) 将小鼠放于 70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入 5ml 含有 2.5FCS 的 1640 液中，冰浴
4、下轻轻洗去脾上的红血球。反复离心分离镜检略过。略过。 瘤细胞复苏瘤细胞复苏注：注：瘤细胞必须来自于和瘤细胞必须来自于和 B B 细胞同品系的细胞同品系的 Balb/cBalb/c 鼠，消除细胞融合时起免疫反应鼠，消除细胞融合时起免疫反应。该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好 106 个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。 细胞融合与筛选细胞融合与筛选（1）、取末次免疫后的
5、第 3 天小鼠脾细胞悬液，将 108 小鼠脾细胞与 1-5107SO2/O 小鼠骨髓瘤细胞混合于 50 毫升刻度离心管中，经 1000 转/分离心 7 分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置 37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3）、将 37水浴中保温的 50%PEG1.0 毫升（实际应用 0.7 毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在 60 秒钟内滴完，在 37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4）、加完 PEG 后，将细胞悬液放在 37水浴中静置 90 秒钟，立即在 24 分钟内加入 15 毫升无血清的 RPMI-1640 培养
6、基（37），开始要一滴一滴地加，由于稀释使 PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；5）、再经 100 转/分离心 10 分钟。弃去上清液，加 25 毫升 HAT 培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个 24 孔培养板中，每孔 0.5 毫升；6）、将培养板放在水蒸汽饱和 CO2 孵箱中，37孵育。CO2 含量为 5%；7）、每 23 天换一次 HAT 培养液，连续 2 周观察杂交瘤细胞是否出现。2 周后使用HT 培养基。 杂交瘤细胞培养与生产杂交瘤细胞培养与生产一一、对于选育出来的杂交瘤细胞，还要对其进行驯化、实验室小试、中试后才能进入化工厂生产。二、二、工艺路线的优化。三、三、培养条
7、件的控制与优化。四、四、发酵设备的设计改造等等 单克隆抗体的分离制备、纯化及检测单克隆抗体的分离制备、纯化及检测经过人工手段，单克隆抗体是一种高效分泌胞外蛋白，其分离制备方法与其他活性蛋白方法具有一般相似性。已完成的或正在研制多种抗 SARS 病毒疫苗中, SARS 灭活和减毒病毒疫苗的研究已取得一定成果, 但由于该类疫苗本身的一些生物学特性, 应用受到了限制, 因此新型基因工程疫苗仍是研究的重点。参考文献：参考文献：1 鲍海逊,夏梅,缪凤琴,谢维,张建琼. SARS 冠状病毒 S 蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备J. 东南大学学报(医学版), 2009,19 页2 戚扬; 郝俊勤; 迟淑萍; 孙艳玲; 赵景民; 程云; 用抗 SARS 冠状病毒 N 蛋白单克隆抗体定位研究受染器官，传染病信息, 2009 年 01 期 -32 页 3 杨保安，抗 SARS 冠状病毒中和活性单克隆抗体的筛选及其结合位点分析，中华微生物学和免疫学杂志，2006,-15 页。
