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1、普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定作者：曹海石 添加日期： 2011-08-20 23:21:02 浏览： 270 次 普鲁兰多糖是由茁芽短梗霉(A u reobasid ium p u llu lans) 分泌的胞外多糖 1 , 它具有无毒害、粘结性强和成膜性好等优良特性, 可作为食品、医药方面的粘合剂和包装材料. 此外, 也广泛应用于水果蔬菜保鲜、种子保护、化妆品和卷烟生产等方面, 是一种新型的多功能生物产品, 有较好的应用前景 2, 3 . 目前, 普鲁兰多糖的应用国外已申请了多项专利, 我们实验室经紫外诱变筛选出一株高产普鲁兰多糖的菌株(A u reobasid ium p u llu l
2、ans JB518) 4 , 对其产生的多糖进行了分离纯化, 该纯化方法简便、回收率高. 同时通过薄层层析、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行了鉴定, 证实了它的基本结构单位为麦芽三糖, 每个麦芽三糖之间由 A(16) 糖苷键相连, 这为该变异菌株的应用提供了理论依据. DEA E2 纤维素为 W hatm an 产品, Sephadex G2100 为 Pharm acia 产品, 普鲁兰多糖 (Pu llu lan) 标准品、 麦芽三糖和普鲁兰酶(EC. 3. 2. 1. 41) 为 Sigm a 产品, 其它化学试剂均为国德国 B ruker 1FS66V 真空型红外光谱仪. 美国 V
3、 arian 公司 U n ity 400 NMR 仪.将本实验室经紫外诱变获得的茁芽短梗霉(JB518) , 在含 2% 蔗糖, 012% 的酵母浸膏, 012% KH2PO 4, 0. 1%MgSO 47H2O , 0. 1%NaOH 和 0. 04% (NH4)2 SO4 的液体培养基中培养, 在 250 mL 锥形瓶中加入 50 mL 培养基, 用接种环移菌 3 次, 于 28 发酵 96 h, 发酵液 in 的转速下离心 30 m in, 去沉淀, 上清液加入 2 倍无水乙醇, 搅拌、放置过夜,使普鲁兰多糖充分沉淀. 沉淀液以 4 500 r/min 离心 30 min, 得普鲁兰多
4、糖沉淀, 沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤, P1O5干燥, 即得普鲁兰多糖粗品, 从 50 mL 发酵液中可得其粗品 115 g.1. 3 多糖及蛋白质含量的测定采用改良的苯酚 2 硫酸法 5 . 取待测溶液 012 mL , 加入浓度为 50 gL 的苯酚溶液 014mL , 混合均匀后迅速加入 2 mL 浓H2SO 4, 振荡摇匀, 于室温放置 30 m in, 用 721 分光光度计在490 nm 处测定光吸收值.采用 Low ry 法 6 , 以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白质含量.1. 4 核磁共振光谱测定及薄层层析1H NMR 频率 399195MHz, 90 脉冲 25 Ls, 脉冲延
5、迟时间 316 s, 累加 128 次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 2150, 样品浓度 5% (质量体积分数) , 控温误差0. 1 .13C NMR 频率 100157MHz, 90 脉冲 14 Ls, 脉冲间隔 115 Ls, 宽带噪音去偶, 累加 3 000次, 溶剂 DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 39160, 样品质量体积分数 12% , 控温误差0. 1 .薄层层析(TLC) 采用硅胶板法 7 . 在 10 g 硅胶 G260 干粉中加入0102mo lL 的乙酸钠溶液 25 mL , 搅拌均匀, 平铺在玻璃板上, 自然晾干后,
6、于 120 加热活化 30 m in, 制成硅胶板.1. 5 刚果红实验Fig. 1 Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by waterFig. 2 Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by Na2B4O7 solution参照文献 8 方法. 刚果红溶液浓度为 21510- 5 mo lL , 普鲁兰多糖溶液质量浓度为10 m gmL. 将 N aOH 依次配成不同浓度(012 110 mo lL ) , 将普鲁兰多糖溶液和刚果红溶液混合(体积比 11) , 然后加入与混合液等体积的不同浓度的 N aOH, 静置
7、15 m in 后, 用721 分光光度计依次测定混合液在不同浓度的 N aOH 溶液中最大吸收波长的变化(以刚果红溶液为对照).2 结果与讨论2. 1 普鲁兰多糖的纯化2. 1. 1 Savage 法 参照文献9 方法. 将 610 g 普鲁兰多糖粗品稀释成 115% 的水溶液 400mL , 加入 100 mL 氯仿丁醇混合液(体积比 41) , 充分振荡使蛋白质析出, 以 2 000 rm in离心 30 m in, 除去沉淀, 将上清液再用此方法处理, 重复 7 次. 最后得到脱去蛋白的上清液.将该上清液逆向流水透析 3 d, 将其减压浓缩至 200 mL 左右, 加入2 倍体积无水乙
8、醇, 充分搅拌, 放置过夜, 使普鲁兰多糖沉淀, 沉淀液以 4 500 rm in 离心30 m in, 将沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤, P2O 5 干燥, 得普鲁兰多糖粉末 518 g.2. 1. 2 DEA E2 纤维素柱层析 将经 Savage 法除蛋白的普鲁兰多糖粉末溶于 10 mL 蒸馏水中, 进行 DEA E2 纤维素(硼酸型) 柱层析(313 cm 40 cm ) , 洗脱速度为 1 mLm in. 首先用蒸馏水洗脱, 分部收集(每管 5mL ) , 用改良的苯酚 2 硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图 1所示. 收集多糖峰, 减压浓缩、透析、冷冻干燥得 412 g 样品 1.
9、 该层析柱用 0112mo lL 硼砂洗脱, 洗脱曲线如图 2 所示. 同样收集多糖峰, 浓缩、透析、冷冻干燥得 115 g 样品 2.0 3 7 1 高等学校化学学报 Vo l. 20 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.2. 1. 3 Sephadex G2100 柱层析 分别取样品 1 和样品 2 溶液进行 Sephadex G2100 柱层析(1 cm 100 cm ) , 进样量为 015 mL , 样品质量分数为 017% , 用蒸馏水进行洗脱, 洗脱速度为 4 mLh , 用
10、改良的苯酚 2 硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图 3 和图 4 所示. 样品 1和样品 2 各有一个洗脱峰, 收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末410 g P1 和 112 g P2.Fig. 3 Gel f iltration of sample 1 on SephadexG-100 columnFig. 4 Gel f iltration of sample 2 on SephadexG-100 column经过 Savage 法、DEA E2 纤维素柱层析及 Sephadex G2100 柱层析将发酵得到的普鲁兰多糖进行纯化, 获得了纯品普鲁兰多糖, 总收率 6617%.2. 2
11、结构研究2. 2. 1 薄层层析 取普鲁兰酶 1 m g (含 4 个酶活力单位) 溶于115 mL 柠檬酸 2 磷酸二氢钠缓冲液中(pH 510, 0103 mo lL ) , 将酶液均匀分为 3 份, 分别加入 10 m g 普鲁兰多糖标准品、P1 及 P2, 然后在 37 培养箱中保温酶解 2 h, 将酶解液以标准麦芽三糖为对照在 G260 硅胶薄板展层, 展层体系为乙腈水(体积比 851) , 以硫酸甲醇(体积比13) 为显色剂, 展层完毕后将显色剂喷于硅胶板上, 在 105 加热显色. 由于普鲁兰酶可特异地水解多糖分子中的 A(16) 糖苷键, 而对其它糖苷键并没有作用, 所以普鲁兰
12、多糖在普鲁兰酶的作用下, 水解为麦芽三糖, 而其它多糖却无此结果. 从薄层层析图谱中可见, 普鲁兰多糖标准品和 P1 被普鲁兰酶水解后都形成了麦芽三糖. 说明 P1 是由 A(16) 糖苷键结合的麦芽三糖所组成, 即是普鲁兰多糖. P2 在酶的作用下没有发生降解, 依然是多糖大分子, 停留在原点位置, 从而证明 P2 不是普鲁兰多糖而是其它多糖.2. 2. 2 红外光谱 P1, P2 及标准普鲁兰多糖的红外光谱分析表明, 多糖分子的特征峰为1 200 1 030 cm - 1 处的 MC= O 峰和 930 900 cm - 1 处的 D 2 吡喃葡萄糖环振动峰 10, 11 . 普鲁兰多糖标
13、准品与 P1 谱中出现多糖的特征峰, 其两条谱线几乎完全相同, 但与 P2 谱线相差较大,说明 P1 为普鲁兰多糖, P2 为其它糖分子.2. 2. 3 核磁共振 将纯品普鲁兰多糖 P1 经核磁共振光谱分析, 其质子峰位移出现在D 3. 1 5. 4 之间, 由于OH 效应致使谱峰略增宽. 环侧基CH2OH 的特征峰出现在D 60. 34, 60. 58 处, 表明结构单元中含 2 个CH2OH 基团. 由于多糖相连, 其糖苷键相连的C1 峰移向低场, 出现在 D 98174, 100156 和 101129 处, 证明结构单元含有不等同的 C1, 其它各峰出现在 D67. 03 80. 61
14、 处. 由 1H 和 13C NMR 特征峰可知, 该样品与普鲁兰多糖的结构一致.2. 2. 4 刚果红实验 刚果红(Congo red) 是一种染料, 分子式为C32H22N 6O 6S2N a2, 它可与具有多股螺旋构象的多糖形成配合物, 配合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移. 在一定的 N aOH 浓度范围内, 配合物出现亚稳区 12 . 普鲁兰多糖在刚果红实验中, 与刚果红配合物1 3 7 1 No. 11 曹海石等: 普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights rese
15、rved.的最大吸收波长虽然也发生红移, 但未出现亚稳区, 表明普鲁兰多糖分子并不存在多股螺旋构象. 这是由于普鲁兰多糖分子是由重复单位麦芽三糖经 A(16) 糖苷键连接而形成的线性分子, 在该多糖的糖链中存在大量的(33% )A(16) 糖苷键, 由于 A(16) 糖苷键存在一定的旋转自由度, 所以缺乏刚性, 在水溶液中有很大的柔曲性, 不易形成螺旋构象. 此外, 虽然普鲁兰多糖分子也含有 66% 的A(14) 糖苷键, 但在一个重复单位中(3 个葡萄糖分子) 由于空间位阻也很难形成螺旋结构. 因而普鲁兰多糖分子不可能具有单股螺旋、带状等规则结构 13 . 其在水溶液中的构象只能为无规卷曲.综上所述, 我们诱变得到的高产菌株(A u reobasidium pu llu lan s JB518) 经发酵得到的多糖确为普鲁兰多糖, 其构象为无规卷曲.
