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1、1关于血球计数板的使用及问题讨论一、血球计数板的使用原理显微镜直接计数法显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。血球计数板血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有 9 个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为 1mm，深度为 0.1mm,其容积为0.1mm3，即 1m
2、m1mm0.1mm 方格的计数板；大方格的长和宽各 2mm,深度为 0.1mm,其容积为 0.4mm3，即 2mm2mm0.1mm 方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25 为计数板的型号和规格，表示此计数板分 25 个中格；0.1mm 为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是 1mm2，分 400 个小格，每小格面积是 1/400 mm2。计数室通常也有两种规格：一种是 16251625 型型，即大方格内分为 16 中格，每一中格又分为25 小格；另一种是 25162516 型，即大方格内分为 25 中格，每一中格又分为 16 小
3、格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是1625=2516=400 个小方格组成。211625 型的计数板 将计数室放大，可见它含 16 中格，一般取四角：1、4、13、16 四个中方格（100 个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见 25 个小格。计数重复3 次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL=100 个小方格细胞总数/100 40010000稀释倍数22516 型的计数板 中央大方格以双线等分成 25 个中方格，每个中方格又分成 16 个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80 个小方格）的细
4、胞数。计数重复 3 次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL 80 个小方格细胞总数/80 40010000稀释倍数c c d d血球计数板的构造（三）（2516）a顶面观 b侧面观 c放大后的网格 d放大后的计数室二、血球计数板的使用方法步骤1镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。2加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。多余培养液可用滤纸吸
5、去。3计数。稍待片刻（约 5min），待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。3三、血球计数板的使用注意事项 培养液中酵母菌种群数量的动态变化实验是一个历时较长（7 天左右）的实验， 事前一定要做好周密的计划，定程序、定时间、定人员。每天采用抽样检测法使用血球计 数板对酵母菌进行计数，在计数时应从以下几方面注意： 1每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续 观察 7 天。 2从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀， 防止酵母凝聚沉淀，提高
6、计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。 3如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。 具体方法是：摇匀试管，取 1mL 酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释 n 倍后，再 用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有 45 个酵母细胞为宜。特 别是在培养后期的样液需要稀释后计数。 4活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体 小于母细胞一半时为 1 个酵母细胞。 5对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线 不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数
7、。计数时，如果使用 16 格25 格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下 4 个中格(即 100 个小格)的 酵母菌数；如果规格为 25 格16 格的计数板，除了取其 4 个对角方位外，还需再数中央 的一个中格(即 80 个小方格)的酵母菌数。 6计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取 其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每 1ml（或 10mL）菌液中所含的酵母菌个数。 7血球计数板的清洁 血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干， 或用 95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机
8、溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否 残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止 四、关于血球计数板的命题 由于实验培养液中酵母菌种群数量的动态变化是新教材新增加的实验，在各地各 类命题中都关注了这一实验，并对血球计数板的使用进行了命题设计。从近年来的各类试 题来看，试题考查的角度不同，大多数是关于细胞数量的计算，也有关于使用原理和方法 的考查，但有的试题明显与血球计数板的实际使用不相符。 例 1 在用血球计数板（2mm2mm 方格）对某一稀释 50 倍样品进行计数时，发现在一个方 格内（盖玻片下的培养液厚度为 0.1mm）酵母菌平均数为 16，据此估算 10mL 培养液
9、中有酵 母菌 个。 （参考答案： 2107） 例 2 在“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”实验中，某同学用显微镜观察计数，统计 发现血球计数板的小方格(2 mm2 mm)内酵母菌数量的平均值为 13 个。假设盖玻片下的培 养液厚度为 0.1 mm，那么 10mL 培养液中酵母菌的个数约为 个。 （参考答案：） A5.2104 B3.25105 C5.2103 D.3.25104 解析一：例 1 例 2 两题，均将整个计数室 2mm2mm 方格作为实验计数的空间，并按照 公式：a/4105（稀释倍数）来计算 10mL 培养液中的酵母菌的数量（a 为所计数酵母菌 的平均数）。与血球计数板的实际操
10、作不相符，特别是例 2 中将 2mm2mm 的计数室当成一 个小方格了，存在有科学性错误。 例 3 通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为 1mm1mm0.1mm 方格， 由 400 个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数，应先 后再计数。若4多次重复计数后，算得每个小方格中平均有 5 个酵母菌，则 10mL 该培养液中酵母菌总数有 个。（参考答案：稀释；2108） 解析二：例 3 设计了血球计数板的规格，还考查了血球计数板的使用方法，较例 1 例 2 更科学合理。根据公式：540010000102108。 例 4 检测员将 1 mL 水样稀释 10 倍后，用抽样检测的方法检测每毫升蓝藻的数量；将盖 玻片放在计数室上，用吸管吸取少许培养液使其自行渗入计数室，并用滤纸吸去多余液体。 已知每个计数室由 2516400 个小格组成，容纳液体的总体积为 01 mm3。现观察到图中该计数室所示 a、b、c、d、e 5 个中格 80 个小格内共有蓝藻 n 个，则上 述水样中约有蓝藻 个mL。（参考答案：5n105 ） 解析三：从例 4 来看，是按照血球计数板的原理进行设计试题的，还添加了相应的图示， 题意一目了然。按照前面所述的公式，不难得出正确答案：酵母细胞个数1mL80 个小 方格细胞总数/ 80 40010000稀释倍数n/ 8040010000105n105
