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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, April 25; 25(4): 503-508 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2009 Institute of Microbiology, CAS Accepted: February 4, 2009 Supported by: Jilin Medical College Research Program (No. 2008-01), Key Scientific and Technological Project of Xinjiang Uygur A
2、utonomous Region (No. 200631109). Corresponding author: Xiaoyan Pan. Tel: +86-432-4560019; E-mail: 吉林医药学院科研专项基金(No. 2008-01), 新疆维吾尔自治区重点科技攻关项目(No. 200631109)资助。 动物及兽医生物技术化学辅助去核法对绵羊卵母细胞去核率和重构胚发育率 的影响 潘晓燕1, 王正朝2, 李质馨1, 金玉姬1, 窦肇华1, 郭志勤3, 王锋4 1 吉林医药学院 组织学与胚胎学教研室, 吉林 132013 2 弗吉尼亚联邦大学医学院, 里士满 23298 3 新疆
3、畜牧科学院 农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室, 乌鲁木齐 830000 4 南京农业大学 动物胚胎工程技术中心, 南京 210095 摘 要: 为提高绵羊体细胞核移植的效率, 本研究采用一种新的去核方法化学辅助去核法, 对绵羊体外成熟的卵母细胞进行去核, 研究了化学诱导剂秋水仙素的处理浓度、作用时间、 卵母细胞的成熟时间对去核效果及重构胚发育的影响。 结果表明: 1) 卵母细胞在 0.4 g/mL 的秋水仙素溶液中分别孵育 0.5 h 和 1 h, 胞质突起率和去核率没有显著的差异, 突起率可高达 85.4%, 去核率达到 100%; 2) 0.2 g/mL 或 0.4 g/mL 秋水仙素
4、溶液将卵母细胞处理 0.5 h, 对去核效果没有显著影响; 3) 对于体外成熟 1823 h 的卵母细胞, 随着成熟时间的延长, 盲吸法的去核率降低, 但没有影响秋水仙素诱导胞质突起的比率和去核率; 4) 两种去核方法对重构胚的发育没有产生显著影响, 但成熟 2123 h 卵母细胞重构胚囊胚的发育率显著高于成熟 1820 h 卵母细胞重构胚囊胚的发育率。 综上所述, 本试验优化了绵羊卵母细胞化学辅助的去核程序, 利用化学辅助去核法对高卵龄的绵羊卵母细胞进行去核, 提高了去核率和重构胚的体外发育率。 关键词: 秋水仙素, 卵母细胞, 化学辅助去核, 重构胚 Effect of the chemi
5、cally assisted enucleation on the enucleation of sheep oocytes and the development of their reconstructed embryos Xiaoyan Pan1, Zhengchao Wang2, Zhixin Li1, Yuji Jin1, Zhaohua Dou1, Zhiqin Guo3, and Feng Wang4 1 Department of Histology and Embryology, Jilin Medical College, Jilin 132013, China 2 Med
6、ical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, USA 3 Key Laboratory of Animal 通过激活卵母细胞, 去除末期卵母细胞染色体的方法也是有效的4, 但激活后, 随着卵母细胞内 MPF 活性的降低, 其重编程体细胞核的能力也随之降低5。 随着研究的深入, 不同物种卵母细胞的去核方法不断改进。化学诱导法在小鼠、山羊、牛、猪等动物的卵母细胞上也进行了应用研究, 其是在卵母细胞减数分裂的过程中添加化学诱导剂, 破坏纺锤体微管的功能, 使得极体排出时不能与核染色体发生
7、分离, 因此与核染色体一起被排到卵周隙, 以达到去核的目的, 其整个去核过程不需要显微操作仪。该方法简单、易于操作, 但研究发现利用不同的化学诱导剂诱导去核后, 胞质支持重构胚发育的能力不同, 且不同物种的卵母细胞诱导的效果也有很大差异, 因此限制了该方法的广泛应用6, 7。在此基础上, Yin 等8和 Tani 等9以猪和牛的卵母细胞为试验材料对化学诱导去核法进行了改进, 用化学诱导剂 Deme 处理成熟排出第一极体的卵母细胞, 使卵胞质中含染色体的部分形成一个胞质突起, 这样就能明确核所在的位置, 然后通过显微操作, 将核与极体一并除去, 达到去核的目的, 此法被称为化学辅助去核。 该法对
8、卵母细胞损伤少, 且由于化学诱导剂作用时间短, 减少了对胞质的毒副作用, 可得到较高的重构胚发育率, 有望在其他动物上推广应用。 本试验是首次利用秋水仙素对绵羊卵母细胞进行化学辅助去核, 旨在建立一套操作简便、 对卵母细胞损伤少、 高效稳定的去核方法, 以期进一步提高绵羊核移植效率, 简化核移植程序。 1 材料与方法 1.1 试剂 胚胎的培养器皿购自 Costar 公司; 胎牛血清(FBS)为 Hyclone 公司产品; 促黄体素(LH)为中国科学院动物研究所生殖内分泌室产品; 其他药品除特殊注明外均购自 Sigma 公司。 抽 卵 液 : 2%(V/V)FBS+HEPES缓 冲 的TCM19
9、9(H199); 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 培 养 液 (IVM 液 ): 10%(V/V)FBS+5 g/mL 促卵泡素(FSH)+0.3 IU/mL LH+1 g/mL -雌二醇的 TCM199(M199); 显 微 操 作 液 : 7.5 g/mL 细 胞 松 弛 素B(CB)+10% FBS 的 H199; 融合液: 0.3 mol/L 甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2+ 0.1 mmol/L MgCl2+0.5 mmol/L HEPES+0.05% BSA; 激活液包括 5 mol/L 离子霉素(Ionomycin)的H199 和 2 mmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6
10、-DMAP)的合成输卵管液(SOF 液); 胚胎培养液: 1%非必须氨基酸+2%必须氨基酸+4 mg/mL BSA 的 SOF 液。 1.2 卵母细胞的体外成熟 从屠宰厂摘取刚屠宰的绵羊卵巢, 置于 30oC 左潘晓燕等: 化学辅助去核法对绵羊卵母细胞去核率和重构胚发育率的影响 505 J 右的生理盐水中, 2 h 内运到实验室。用手术刀片割开卵巢表面 15 mm的卵泡, 挑选卵丘细胞包裹 3层以上、结构致密的卵丘-卵母细胞复合体(COCs), 放入 100 L 的 IVM 液滴中, 在 38.6oC、 5% CO2、 100%湿度的培养箱中成熟培养 1823 h。将成熟的 COCs放入 0.
11、1%透明质酸酶中, 脱去包裹卵母细胞的卵丘细胞, 选择卵周隙明显、细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞备用。 1.3 成熟卵母细胞的盲吸去核 将成熟不同时间的带有第一极体的卵母细胞置于含 5 g/mL Hoechst33342 的 M199 中孵育 10 min, 将孵育后的卵母细胞移入显微操作液滴中, 在配有显微操作臂的 200 倍倒置显微镜下, 用一内径为 20 m 的吊尖斜口去核针将第一极体及其下方胞质内的染色体一并吸除。 然后在荧光显微镜下观察去核后的卵母细胞有无荧光, 统计卵母细胞的去核率。 1.4 成熟卵母细胞的化学辅助去核 将成熟不同时间的绵羊卵母细胞放在添加不同浓度秋水仙素的 M
12、199 中处理不同的时间, 在显微镜下可见到卵母细胞膜上出现类似“芽孢”样的突 起10, 将有胞质突起的卵母细胞移入显微操作液滴中, 在配有显微操作臂的 200 倍倒置显微镜下, 用一内径为 20 m 的吊尖斜口去核针将此突起及第一极体一并吸除。然后将去核的卵母细胞在 5 g/mL Hoechst33342 的 M199 中孵育 10 min, 在紫外光下快速照射, 检查去核率。 1.5 核移植重构胚的构建 将去核后的卵母细胞放在显微操作液滴中, 用一内径为 20 m 的吊尖斜口去核针吸取消化好的直径为 1520 m、表面光滑的成年绵羊耳皮肤成纤维细胞, 从透明带原切口处移入去核卵母细胞的卵周
13、隙中, 尽量使供体细胞紧贴卵细胞膜。然后将构建好的重构胚在融合液中平衡 2 min, 移入融合槽中, 使供体细胞与卵母细胞接触面与电场方向垂直, 施以场强为 1.2 kV/cm, 脉冲时间为 20 s, 脉冲次数为 2 次的直流脉冲进行融合(融合仪为宁波新芝生物公司生产), 融合后 0.5 h检查融合率, 挑选融合胚进行激活处理。 1.6 重构胚的激活与培养 将重构胚在 5 mol/L Ionomycin 液中作用 4 min, 之后移到 2 mmol/L 6-DMAP 液培养 3 h, 最后放入胚胎培养液滴中, 在 38.6oC、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养, 2 d 后统计卵裂
14、率, 7 d 后检查囊胚发育率。 1.7 统计分析 所 有 试 验 均 重 复 4 次 , 以 统 计 分 析 软 件SPSS12.0的ANOVA或T检验进行差异显著性分析。 2 结果与分析 2.1 秋水仙素处理时间对化学辅助法去核率的影 响 成熟 2123 h 的绵羊卵母细胞, 在 0.4 g/mL 的秋水仙素溶液中分别孵育 0.5 h 和 1 h, 前者的胞质突起率稍高于后者, 但差异不显著(85.4% vs 82.6%), 且只要将突起的胞质和第一极体一并去除, 去核率就能达到 100%。 但考虑到秋水仙素对卵母细胞的毒副作用, 孵育 0.5 h 比较合适(表 1)。 表 1 秋水仙素处
15、理时间对化学辅助法去核率的影响 Table 1 Effects of colchicine treatment duration on the enucleation rate of oocytes by chemically assisted enucleation Duration (h) Number of oocytes Rate of cytoplast protrusion (%) Rate of enucleation (%) Experiment group I (0.5 h)82 85.43.1 100 Experiment group II (1 h) 109 82.62.3 100 Control group 76 0 2.2 秋水仙素处理浓度对化学辅助法去核率的 影响 本试验参照国内外相关文献, 比较了 0.2 g/mL和 0.4 g/mL 的秋水仙素对成熟 2123 h 绵羊卵母细胞处理 0.5 h 后的胞质突起情况。 结果表明二者的胞质突起率没有显著差异, 去核率均为 100%, 如表 2所示。由此可见, 在不影响胞质突起率和去核率的前提下, 可以将秋水仙素的浓度降低到 0.2 g/mL进行使用。 2.3 卵母细胞成熟时间对盲吸法和化学辅助
