色谱分析法在药物分析中的应用

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1、色谱分析法在药物分析中的运用色谱分析法在药物分析中的运用气相色谱法测定丁香药材中丁香酚的含量气相色谱法测定丁香药材中丁香酚的含量丁香 Eugenia caryopbllata Thunb药材来源于桃金娘科植物的干燥花蕾，收载于中国药典 1995 年版一部。在 95 版药典中，丁香药材的音量测定只收载了测定挥发油音量的方法，但没有测定挥发油中丁香酚丁香酚(C10H12O2)的音量。为进一步控制和考察丁香药材中丁香酚的音量，我们分别采用了浸溃法和挥发油提取法，提取后用气相色谱气相色谱法分别来测定丁香药材中丁香酚的音量。1 仪器与试砖GC-9A 和 GC-14B 气相色谱议(日本岛津)。10%PEG

2、-20M 色谱柱。丁香酚耐照品 购自中国药品生物锚品检定所(批号：7258802)，经标化其音量为 98%以上，其它试剂均为分析纯。2 方法与结果2 1 色谱条件厦系统适用性试验：色谱柱：lO%PEG-20M，检测器FID，N2：60kPa，柱温：180，进样口温度：250，衰减 2。在上述条件下丁香酚峰与其它组分峰均能达到基线分离，且出峰对间较快，峰形较好，阴性样品无干扰。吸取上述对照品溶液 1L，注人气相色谱仪，结果理论塔板数 n 1200。拖尾因子在 0.951.05 之间，校正因子的相对标准偏差小于 2.0%。28 供试品和对照品溶液的制备22 1 提溃时间的确定：在试验研究中比较了不

3、同浸渍时同丁香药材中丁香酚的含量。上述结果表明，浸渍 24 h 以上，丁香药材中的丁香酚已浸渍完全。222 供试品溶液的制备：取本品粗粉约 0.6g，精密称定，量具塞锥形瓶中，精密加入乙醇 2OmL，称定重量，摇匀 t 宣温放量 24h 以上，再称定重量，补足损失重量，振摇后放量，用滤纸滤过。精密量取滤液 5mL，量 25mL 的容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，作为供试品溶液。22 3 对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加无水乙醇溶解，制得0.492 mgmL 的溶液，作为对照品溶液。23 线性范围的考察 分别精密吸取上述对照品溶液0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、4、5L，按上

4、述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵座标，丁香酚音量为横座标，计算得回归方程 Y= 9.2610000X 一35.94，r=0.9999，表明丁香酚在 0.2462.46ng 具有良好的线性关系。24 精密度试验：精密吸取丁香酚对照品溶液 1L，重复进样 6 次，结果测得平均峰面积为 151654，RSD 为 1.3%。2. 5 重现性试验：取同一批药材 5 份，按丁香酚音量测定方法操作，结果丁香酚音量的平均值为 121.02mgg，RSD 为 0.7%。26 回收率试验：采用加样回收法，精密称取已知音量的丁香药材 0.1 g(每克药材吉丁香酚 121.6mg)，分别加对照品适量，按音量测

5、定方法试验，结果平均回收率为 98.6，RSD 为 0.5%。27 样品音量的测定 分别取不同来源的 5 批丁香药材，按吉量测定方法试验，分别测定丁香酚的含量。3 小结实验结果表明，采用浸溃提取法比挥发油提取法简便、可控和准确，可以作为该药材的质量检控指标之一。HPLC-ELSD 在药物分析中的应用在药物分析中的应用1、在天然药物及复方成药分析中的应用ELSD 能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品，天然产物中的许多成分无疑找到了直接、准确的测定方法。ELSD 在天然产物及其复方成药分析中的应用报道主要有皂苷类、生物碱类、萜类内酯等。皂苷无紫外吸收或仅为末端吸收，ELSD 能够对其不经衍

6、生进行检测，在 HPLCELSD 的应用中这方面的报道最多。主要有一次性分离分析天然人参人参、生脉散复方、育精胶囊中的多种人参皂苷人参皂苷；西洋参西洋参中的人参皂苷和拟人参皂苷定量测定；三七三七中的三七皂苷的含量分析；黄芪黄芪、黄芪注射液和保元汤中的黄芪皂苷、黄芪甲甙的分离和测定；麦冬中的甾体皂甙元；天麻天麻中的天麻甙的含量测定等。这些研究主要采用 Cl8 柱、乙晴与水作流动相，不经衍生直接测定多组分含量，结果显示方法灵敏度高(一般检测限低于 3gm1)、线性关系良好。对于无紫外吸收的生物碱类成分，ELSD 同样显示出操作简单、灵敏度高的优点。对比 HPLCUV 法测定贝母中的甾类贝母生物碱，

7、采用 ELSD 检测器，不但不需衍生化操作，提高了结果的准确度，而且可检测出不含双键的贝母甲素，对动物体内的生物碱类成分如河豚毒素，无紫外吸收且安全性低，不适合衍生化法，可用ELSD 法进行检测，获得满意结果。银杏作为一种保健药品，其主要活性成分为黄酮类和萜类内酯，以往银杏中的萜类内酯成分主要采用 HPLCUV 法和HPLCRI 测定，但由于萜类内酯紫外吸收差，又含少量物质的干扰，结果稳定性和准确性较差随着 ELSD 的发展和普及，这些方法已经逐渐被 ELSD 法所取代。2、 在抗生素分析中的应用HPLCELSD 早在 20 世纪九十年代就用于天然产物分析，随着技术的发展，其应用范围已逐渐扩大

8、，近年来屡有用 HPLCELSD 分析抗生素类药物的报道，HPLCELSD 分析抗生素类药物的报道多见于氨基糖苷类抗生素、氨基糖苷类抗生素是临床上常用的抗生素，可通过微生物发酵或半合成制得，是一类单组分或多组分糖基取代的氨基环醇类化合物，主要有：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、小诺霉素等。对这一类抗生素的含量测定多采用微生物法，但微生物法测定的是各活性组分的总量，无法反映各组分组成。为克服这个缺点，国内外的药典采用 HPLC 法进行测定，但这类抗生素无紫外吸收，只能采取衍生化法(多为柱前衍生)，结果易受衍生化反应条件的影响而不够准确，ELSD 法很好地解决了这个问题。氨基糖苷类抗生素含多

9、个氨基，可产生含不同当量无机酸盐产品，对于这些副产物成分，ELSD 也能很好的加以测定。高效液相色谱高效液相色谱 - 荧光衍生法在体内药物分析中的应用荧光衍生法在体内药物分析中的应用体内药物分析是在大量复杂组分中进行微量或超微量药物及代谢产物的测定。体内药物分析最常用的检品是血样(血浆、血清、全血)、尿样、唾液及组织液, 特殊情况下也采用乳汁、泪液、胆汁、羊水、粪便等1。随着药物的开发研究, 药物的服用剂量越来越小, 体内药物的浓度越来越低, 这对分析方法灵敏度和选择性等都提出很高的要求2。高效液相色谱法具有准确、灵敏度、专一性强等特点, 一直是体内药物分析的主要手段3。而高效液相色谱的荧光检

10、测器比紫外吸收检测器灵敏度高。具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达 ng水平, 而荧光衍生物一般的检测水平为 10-1210-14m ol/L,灵敏度比紫外检测器提高 101000 倍4。故 H PLC 法结合荧光检测法所具有的较高的选择性及灵敏度以及试样用量少的特性, 使得对复杂生物样品中药物及其代谢物的测定变得更加灵敏、准确、快速。但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光. 对于不产生荧光或荧光较弱的样品灵敏度很低, 甚至不能检测。为了扩大检品范围, 提高检测灵敏度, 常采用荧光衍生法。荧光衍生法是指在一定条件下利用某种试剂与样品中待测组分相作用, 使其产物具有荧光或荧光增强。另外,荧光

11、检测器选择性好, 过量的试剂和副产物往往不产生干扰, 衍生物亦不必纯化, 因此荧光衍生技术的采用, 扩大了高效液相色谱 - 荧光测定法在体内药物分析中的应用范围, 为药物代谢动力学, 临床药理学和毒理学等研究提供科学依据。荧光衍生化反应根据衍生反应的场所来分, 有柱前衍生化(pre-colum n derivatization), 柱上衍生化(on-colum n derivati-zation)和柱后衍生化(post-colum n derivatization)三种. 从是否与仪器联机的角度来分有: 在线(on-line)、离线(of-line)和旁线(at-line)(自动化)三种. 目

12、前在 H PLC 中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多. 旁线衍生化方法是发展方向5。1 衍生化试剂常用的荧光衍生化试剂有: 荧光试剂和荧光染料荧光胺(fluorescam ine, 又名胺荧) 、邻苯二甲醛(O-phthaldehyde) 、丹酰 氯 (dansylchloride, DNS-Cl)、 氯 化 硝 基 苯 骈 氧 二 氮 茂(NBD-chloride)、等。荧光胺是一常用荧光衍生化试剂, 可同伯胺及大多数氨基酸反应, 反应迅速, 衍生物具有高荧光强度的吡咯啉酮, 而试剂本身则迅速水解为不发荧光的产物, 是一理想的柱前衍生化试剂;

13、丹酰氯是应用最广的荧光衍生试剂, 常用于含氨基药物的测定, 同伯胺和仲胺都能反应, 还可用于含酚羟基药物如雌激素的测定; 邻苯二甲醛, 常用于伯胺类及 - 氨基酸类化合物的荧光分析。胺类化合物的衍生试 剂 还 有 荧 光 素 异 硫 氰 酸 酯 (FITC) 、 芴 代 甲 氧 基 酰 氯(FM OC) 、4- 氯 -7- 硝基 -2,1,3- 苯骈恶二唑 ( NBD-C) 、l6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC) 等610。目前已开发出一些醇和酸的衍生化试剂1113。醇、酚的衍生试剂有: 羰基氯类(FM OC、CEOC) , 氯 甲 酸 芴 甲 酯 (FM OC-C1); 磺 酰 氯 类(

14、DNs-Cl) , 卤代三嗪类有:1- 乙氧基 -4- (二氯 - 三嗪)萘(EDTN ) ; 羧酸类化合物的衍生试剂有: 4- 溴甲基 -7- 甲氧基香豆素 (BrM M C) , 7-N- 哌嗪 -4- 二甲氨基苯骈呋喃重氮(DBD-Pz) 、9- 蒽重氮甲烷 (ADAM ) 、4- 氨甲基 -6, 7- 二甲基香豆素(ADM C)、9-(2- 羟乙基)- 吖啶酮(H EA ) 等。羰基化合物的衍生试剂有肼类: DNs-H 、CEOC-H , 氨基类有氨基甲基芘等。另外, 还有些化学试剂可利用化学反应使一些自身不能产生荧光的化合物转变成荧光化合物。这可能是由于化学反应增加了 电子共轭系统的

15、长度或增加分子结构的刚性和共平面性所致。常用的化学反应有氧化还原反应、水解反应、缩合反应、络合反应、光化学反应等。比如维生素 B1 可在碱性溶液中被 K3Fe(CN)6 氧化成具有荧光的硫色素, 氨苄青霉素在酸性溶液中(pH =2),以甲醛为催化剂, 90加热 2 小时,水解成强烈黄色荧光的化合物。2 生物样品的前处理生物样品中的药物在检测前, 首先应除去蛋白质的干扰, 保证色谱柱的柱效和寿命。去除蛋白质常用的方法有加入沉淀剂和变性试剂, 如硫酸铵、硫酸钠等中性盐、强酸和重金属盐等; 加入可与水混溶的有机溶剂, 如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等。经有机溶剂或酸处理后的生物样品与反相 H P

16、LC 分析相匹配。应用反相 H PLC 时生物样品甚至可以不用有机溶剂萃取, 可将含药的液体样品直接进样或经过简单的去蛋白后进样, 操作简单, 所以应用前景甚为广泛14。另外还有酶消化法、缀合物水解 冷冻干燥等方法。生物样品一般经预处理后, 再进行分离提取。提取的目的是从大量共存物中分离出需要的微量组成 - 药物及其代谢物。常用的方法有溶剂提取和固相分离两种。溶剂提取常用的有机溶剂有正丁醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、苯、正已烷等及它们的混合溶液; 固相分离是将具有吸附或离子交换性质、表面积大的担体作为填充剂, 装于小分离管中 ,将生物样品中的干扰物或药物保留在担体上而进行分离的方法 ,也可认为是微型柱色谱法 2。常用担体有聚苯乙烯、十八烷基键合硅胶、活性碳及硅藻土等。还有将预处理过程与层析过程线上(on-line)进行的 ,在分析柱前加上较短(45cm )的预柱 ,使蛋白质等大分子杂质沉积在预柱上。3 荧光衍生法- 高效液相色谱法3.1 柱前荧光衍生法- 高