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1、脂质体吉西他滨对人前列腺原发肿瘤细胞 LNCAP 异种移植瘤模型的抗转移作 用原位 转移是肿瘤的最大特征，也是威胁患者生命的首要因素。 前列腺癌的致命性主要是由于转移扩散，而不是来自原发肿瘤的负荷。在这里， 我们通过体内成像和体外组织匀浆的荧光素酶检测，监测了 SCID 小鼠前列腺 癌细胞 LNCap 异体移植模型表达的原位荧光素酶/GTP 的生长、转移扩散。尽 管转移扩散一般与原发肿瘤体积有显著的相关性，但是感染动物的不同组织对 转移灶的敏感性、以及各动物个体也是不同的。在这种移植瘤模型中，我们发 现，与传统的 360mg/kg GemLip 相比，在低浓度 8mg/kg 脂质体 GemLi
2、p 对原发 肿瘤的生长抑制与对淋巴结、肺、肾和胃等部位转移瘤的抑制都有效，前言 前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤。仅在德国，每年有近 49000 的新 病例（占男性恶性肿瘤的 22.3%）和 11000 死亡（所有的死亡占 10.4%）。前 列腺癌的转移扩散及其并发症是导致死亡的首要原因，而不是原发肿瘤。 晚期前列腺癌很容易发生转移，倾向于扩散到淋巴结或者骨骼，以及多器 官（肺、肝、肾、脾）转移的特点。一旦前列腺肿瘤细胞骨转移之后，治愈已 不可能，姑息疗法是唯一的选择。 我们研究的目的是要建立一个前列腺原位移植瘤的高转移模型，使用荧光 素酶/绿色荧光蛋白转导植入原位前列腺癌细胞 LNCap，
3、以研究脂质体 Gemlip 是否是前列腺癌的一种新的抗肿瘤转移治疗方案研究方法 1.细胞培养和建立细胞株 LNCaP.FCG，Du145，PC-3 在 DMEM，前列腺细胞倍增时间相似。 2.检测 GemLip 和 gemcitabine 对 LNCaP，Du145，PC-3 细胞的半致死剂 量 每孔 1 千个细胞铺入 96 孔板，24 小时后加药，48 小时后检测。 3.产生表达荧光素酶的前列腺细胞绿色荧光蛋的发光机理比荧光素 /荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能 与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合 作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。 4.动物实验 5.8
4、-12 周龄雄性 SCID 每只小鼠接种 106/25uLDMEM 到前列腺左侧或右侧。通过体内生物荧光检 测原位肿瘤。注射 2106/50ul/matrigel 到 SCID 小鼠的左侧诱导前列腺癌皮下 移植瘤。每周量三次肿瘤大小，并与荧光素酶(绿色荧光蛋白)的成像相比。肿 瘤大小为长宽长/2. 在 23 天后对原位移植瘤动物随机分为三组（每组 10 只），去掉最小和最 大的原位肿瘤，在未接种肿瘤的 SCID 鼠最大的耐受剂量的预实验中，GemLip 和 Gemc 分别为 8mg/kg 与 360mg/kg。对处理组进行 8mg/kg GemLip 与 360mg/kg Gemc 的静脉注射
5、。此外一组为溶剂组。给药三次，每周一次。6.肿瘤血管通透性分析对小鼠静脉注射 100mg/kg 伊文思蓝。30 分钟后，处死小鼠，取血液，肿 瘤及骨骼肌样品，称重，在硫酸钠/丙酮混合液中匀浆。避光室温孵化 17 小时 后，样品离心。取上清测 620nm 处的吸光值。以血样中的血药浓度为标准，测 定伊文思蓝在肿瘤组织及骨骼肌中的含量。7.测量体内生物发光50uL 的 D-荧光素分别腹腔注射到两个部位，然后麻醉动物，10 分钟后， 将它们转入摄像系统。用相应软件定量分析图像中生物荧光的光信号。以光子/ 秒表示。 8.体外定量的检测转移灶的荧光素酶 将 SCID 小鼠的各组织匀浆，离心检测。研究结果
6、 1.体外 LNCAP 细胞对 GemLip 的敏感性 通过对 LNCAP 细胞加入不同浓度的药物制剂 12-120h ，并与 Du145，PC-3 前 列腺细胞相比较研究药物的作用。在 48 小时的时候用 BrdU 法分析对数生长期 的优化和增殖的抑制。如图 1，我们的研究表明，荧光素酶转导的前列腺细胞 对传统的 Gemc 是高度敏感的。图 1 左图的表明，在体外，在各种前列腺细胞 之间，以及 GemLip 与 Gemc 的 IC50 都没有明显的区别。且荧光素酶转导的前 列腺细胞对 Gemc 与 GemLip 与源细胞相比并没有呈现任何敏感性的不同。2.体内前列腺移植瘤的特性：肿瘤生长和血
7、管渗漏 为了比较体内转染 LNCAP 细胞的性质，我们分别比较了肿瘤的生长，血 管渗漏，皮下异位移植及原位移植的转移性特征。肿瘤生长通过生物荧光检测 体内原位移植瘤以及用卡尺测量皮下移植瘤。 LNCAP 皮下移植瘤第一次明显观察到是在第 10-12 天，近 95%小鼠长出肿 瘤。在 19-21 天的时候，肿瘤达到 100cm3，需要开始药物治疗。肿瘤在 32-35 天，长到 1000cm3。使得给药周期为 14 天。原位移植瘤的最初检测到生物荧光在接种后 3-5 天，下一次是 10-13 天。 成瘤率为 65%。以后通过生物荧光每周检测一次肿瘤的生长。终止实验的期限 要根据动物的健康状况和体重
8、的减少（大于 20%）。在本文中， 肿瘤的生长期 限为 54-57 天。使得给药周期为 31-34 天。最终成像的荧光素酶的值与小鼠肿 瘤的大小及体重是相关的。体内 PCa 移植瘤的血管通透性，及血管体积的检测，通过伊文思蓝外渗。 如图 2b 所示，在 SCID 小鼠异位皮下抑制瘤中，伊文思蓝的外渗，肿瘤与肌肉 比率为 3.31。而原位移植瘤明显增大，为 8.13。皮下与原位 LNCAP 移植瘤的转移 在 32-35 天中，没有在任何皮下移植瘤的小鼠组织中发现转移灶。即使用敏感的荧光素酶分析组织匀浆。相反，在未处理的原位移植瘤 SCID 小鼠中发 现了转移灶。在一些动物的尸解的宏观分析中在脾、
9、肺与腹腔发现了转移灶。 然而，在体外灵敏的荧光素分析转导细胞中，各小鼠的所有检测组织中都检测 到转移灶。在淋巴结、脾、十二指肠、肺中较明显，而肱骨、腰椎骨、肾、心 脏组织样品中较微弱。但各个体以及各个体组织中是不同的。 转移灶的分布与最终肿瘤的大小、体重、个体相关。体内脂质体的吉西他滨与吉他西滨对 LNCAP 原位移植瘤的作用 实验动物随机分为三个组，分组五天后给药，大约在接种 28 天后，给药三 次。在脂质体吉他西滨给药期间，通过荧光素酶在体内的生物荧光每周检测一 次肿瘤的生长情况。与对照组相比，对原位移植瘤的药物处理，脂质体吉他西 滨处理组明显的降低了荧光信号，肿瘤抑制率为 83.9%，而
10、吉他西滨组也有类 似的效果，移植瘤为 70.9。脂质体吉他西滨对原代 LNCAP 原位异体移植瘤的转移灶的作用 我们检测了药物处理对抗转移影响。图 6 中分散的点表示实验组各个小鼠的信 号。 与对照组相比，脂质体吉他西滨处理组明显的降低了肿瘤向淋巴结、肺、 肾及胃转移。而 360mg/kg 吉他西滨只明显的降低了肿瘤向肺与胃的转移。问题一：剂量的不同，觉得同样的剂量，从抑制率，有效率方面比较更好。 问题三：接种细胞量不同。 问题四：在抑制原位移植瘤转移灶问题上，是因为药物抑制了转移，还是药物 对转移后肿瘤的抑制。（癌症的姑息疗法是该疗法的目的仅是减轻患者的痛苦，延长患者的生命,使 肿瘤瘤块或有缩小，但不能根除。姑息疗法多半是在病期晚，患者一般情况差， 不能应用根治疗法时才采用的。姑息疗法可有近期的暂时的效果，但患者以后多半还因肿瘤复发、转移而死于肿瘤。） 最最大大耐耐受受剂剂量量 （MTD）：指在外来化合物急性毒性实验中，化学物质不引起 受试对象（实验动物）出现死亡的最高剂量，故可缩写为LD0。若高于该 剂量即可出现死亡。最大耐受剂量是由 90 天毒性实验确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过 对照动物的 10%，并且不引起死亡及不导致缩短寿命的中毒症状或病理损害。
