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1、涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/RhOA、ROcK I 在内异症组织中的表达在内异症组织中的表达内异症是妇科常见的一种良性疾病,其发病率逐年上升,且具有与恶性肿瘤相似的侵袭、转移、复发等生物学行为特性,但其发病机制尚不明确,在临床上又缺乏理想的治疗方法,因此,对内异症临床及基础的研究直是妇科研究领域的热点。而 Rho/Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)是机体各组织中普遍存在的一条信号传导通路,调节细胞骨架的活动,进而参与细胞迁移,已被证实 ROCK 与恶性肿瘤细胞的侵袭密切相关,但其在内异症发病中的作用报道极少:RhoA是 Rho
2、亚族的主要成员之一,属于小分子 G 蛋白超家族,广泛表达于不同类型的细胞和组织中,具有多种生物学功能,主要参与细胞骨架重组、细胞形态改变、细胞移动与黏附、细胞极化和激活 DNA 转录功能。ROCK 又称 Rho 相关激酶,是位于 Rho 下游的关键激酶,能将Rho 的活化信号传递给其底物,从而发挥上述各种生物学作用。ROCK 由两种异构体构成,即 ROCK I 和 ROCK ,本研究通过免疫组化法及蛋白印迹法检测了 RhoA 及其下游激酶 ROCK I 在内异症患者异位内膜和在位内膜组织中的分布及细胞内表达变化情况,并进行定量分析,旨在初步探讨 RhA/ROcK I 介导的信号通路与内异症患者
3、内膜细胞侵袭、种植过程中细胞迁徙的关系,为内异症病因学研究提供理论依据:一、资料与方法1 资料来源:选择 2009 年 10 月至 2010 年 5 月在浙江省衢州市人民医院妇产科行腹腔镜或开腹手术治疗的焖例内异症患者。所有患涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/者均为按照美国生育学会修订的(srlscd Amehcan Fertihtyoe 叮,lAFs)内异症分期期患者.2 分组:异位子宫内膜组(ECE 组,刀=锶):取卵巢异位囊肿囊壁上的异位内膜组织,年龄(434)岁,按月经周期分为分泌期例,增生期28 例。在位子宫内膜组(EUE 组,刀=3
4、0):ECE 组中 30 例患者同时行子宫切除术,取其子宫内膜组织,年龄(453)岁,分泌期 10 例,增生期 20例。子宫内膜组(CE 组,刀=夕):选择同期因子宫肌瘤经腹腔镜或经腹行子宫切除手术的患者 9,例,术后经病理证实为正常子宫内膜并排除合并内异症者,取其正常子宫内膜,患者年龄(佰3)岁,其中分泌期 10例,增生期 17 例。3 排除标准:所有人选患者排除子宫及子宫内膜其他疾病如子宫内膜息肉、子宫腺肌病;排除合并生殖器及其他系统的恶性肿瘤;近 6个月无激素类药物使用史;无糖尿病、高血压、心脏病史,血、尿常规及肝、肾功能均正常。4 免疫组化法检测内膜组织中 RhoA、ROcK I 蛋白
5、定位及半定量表达:采用 Envi“clll 二步法,按试剂盒说明书进行具体操作:标本用4%多聚甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋。蜡块切片(4um)后,脱蜡至水。滴加体积分数 3%双氧水,室温下孵育 10min。用微波进行抗原热修复。滴加 1:10 稀释的一抗(均购于英国 Abtam 公司产品)37孵育 2h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗 2 函 n3 次。二氨基联苯胺(DAB)染色,苏木素复染,脱水、透明、封片后在显微镜下观察,阳性表达在胞质,呈棕褐色,阳性强弱依染色深浅来判断,光镜下每张切片任取 5 个视野进行。使用涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/
6、Imagc 中 ro PlLls60 软件对硐 0 倍光镜下所拍摄的照片进行图像分析,通过测量细胞胞质区域的积分吸光度()值,除以测量面积,得到该区域的平均吸光度(JlFA)值。计算公式如下:i 姒=/a(a=测量面积)。以JFA 代表 RhoA、ROcK I 蛋白表达水平。以 PBS 代替一抗作为阴性对照。5 蛋白印迹法定量检测子宫内膜组织中 RhoA、ROCK I 蛋白表达水平:3 种子宫内膜组织经细胞裂解液作用后,离丿 b 收集上清液,应用蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。取 165ug 蛋白质经%加热10min 使蛋白变性,放置于 1 倍浓度电泳液装置中电泳分离,电转移至聚偏氟乙烯(PVD
7、F)滤膜上,丽春红染色液转膜,加一抗稀释液摇床05h,4过夜后,再与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育 1h,漂洗后,应用化学发光试剂 ECL 显色试剂盒进行检测。结果应用 Illlage Quant LASmini 硐 00 分析软件(美国 BIO-RAD 公司)对显影条带进行吸光度()分析。 6 统计学方法:数据均采用厅s 表示,采用SPSsS16.o 统计软件对各组数据进行单囚素方差分析。二、结果1 各组内膜组织中 RhoA、ROcK I 蛋白定位及半定量表达:(1)各组内膜组织中 RhoA、ROcK I 蛋白定位:RhoA 和 ROCK I 在 3 组患者的内膜组织中均有表达,主要在内膜组
8、织腺体及腺上皮细胞质和细胞膜中表达,内膜间质细胞如缵细胞和血管上皮细胞有散在表达.(2)各组内膜组织巾 RhoA、ROCK I 蛋白阳性表达率:ECE 组 RhllA 总阳性表达率 93.8%(4V48),其中增生期 92.9%(2/),分泌期 95.00%(19/20);涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/EUE 组总阳性表达率 86.7%(/30),其中增隹期 850%(17/20),分泌期90.0%(9/10);CE 组 51.9%(14/27),其中增生期 92.9%(9/17),分泌期。90.0%(5/10)。ECE 组 ROCK I总
9、阳性表达率 91.7%(44/48),其中增生期 92.9%(26/28),分泌期 9O.0%(18/20);EUE 组总阳性表达率83.3%(25/30),其中增生期 85.0%(17/20),分泌期 60.0%6/10);CE 组59.3%(16/27),其中增生期 58.8%(10/17),分泌期 60.0%(6/10)。(3)各组内膜组织中 RhoA、ROCK I 半定量表达:ECE 组 RhoA 蛋白表达水平0.610.13,增生期 0.610.14,分泌期 0.620.13;EUE 组总蛋白表达水平0.100.12,增生期 0.29012,分泌期 0.320.09;CE 组总蛋白表
10、达水平0.120.09,增生期 0.110.09,分泌期 0130.03 组间 RhoA 总蛋白表达水平以及增生期、分泌期蛋白表达水平两两分别比较,差异均有统计学意义(P 均(005)ECE 组 ROCK I 蛋白表达水平 0.590.14,增生期0.580.14,分泌期 0.bt,014;EUE 组总蛋白表达水平 0.300.,增生期0.300.12,分泌期 0.410.l1;CE 组总蛋白表达水平 0.160.12,增生期0.140.09 分泌期 0.170.14;3 组间 ROCK I 总蛋白表达水平以及增生期、分泌期蛋白表达水平两两分别比较,差异均有统计学意义(P 均005)。2 各组
11、内膜组织中 RhoA、ROCK I 蛋白表达水平:RhoA、ROCK I 蛋白在 3 组患者子宫内膜组织中均有表达。RhoA ECE 组为 1 .580.58,显著高+EUE 组 1 .100.26 不口 CE 组 0.450.23(P 均0.01), EUE 组高于 CE 组(P005);ROCK I ECE 组为 1036,显著高于 ELE组 1 .190.23 和 CE 组 0.750 .17(P 均0.01). ErE 组高于 CE 组涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/(P0.05)三、讨论子宫内膜细胞迁徙是完成内膜异位侵袭、种植必需的
12、步骤,是内异症发病的关键,完成这一步骤则需要细胞内外信号分子调控细胞骨架运动的驱动力与肌动蛋白细胞骨架介导的黏附力之间的协调运动。研究结果表明,小分子 G 蛋白 Rho 家族及其效应分子 ROCK I 以多种方式参与上述协调运动过程的调节。近年来,越来越多的研究发现,Rho 儿/ROCK 信号传导通路在恶性肿瘤的黏附和浸润过程中发挥着重要的作用。而内异症的发病过程中的异位种植、侵袭与恶性肿瘤的转移、侵袭过程非常相似,囚此认为其发病机制也有着相似之处。本研究表明,RhoA 和 ROCK I 蛋白在内异症患者异位、在位内膜组织中确有表达,而且主要在内膜腺体及腺上皮的胞质和胞膜上表达,内膜间质细胞有
13、散在的表达如纤维细胞和血管上皮细胞 c 与 Ras 超家族的所有成员一样,Rho 亚家族蛋白不是一种结构蛋白,但其活性调控的调节是一种类似“分子开关”作用的方式在非活性和活性之问循环。当 RhoA 与二磷酸鸟苷(GDP)结合时游离于胞浆中,与三磷酸鸟苷(GTP)结合时则位于细胞膜上,并作用于下游效应分子,诱发细胞反应,表明 Rho 蛋白在细胞内的定位与其发挥的生物学功能一致。Ezrin 蛋白是 Rho/ROCK 信号通道的下游的效应物,参与细胞的形态、运动、侵袭、黏附、极性形成、有丝分裂等过程,从而参与多种病理、生理过程,如恶性肿瘤的转移、伤口的愈合、白细胞的游走涵草堂去黑头收缩毛孔官网：ht
14、tp:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/和吞噬、细胞滋养的侵袭、分娩等,而正常的子宫内膜修复是属于伤口愈合的一种。研究发现,Ez 五 n 蛋白在内异症患者的异位、在位内膜组织和非内异症患者的子宫内膜组织中均有表达,而且其表达在二者间有显著差异。本研究结果表明,RhoA、ROCK I 在内异症患者异位、在位和正常子宫内膜组织中均有表达,两者之间的表达差异与Lhn 蛋白表达趋势相同,即在内异症患者异位、在位内膜组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜组织,且异位内膜中的表达高于在位内膜,囚此推测 RhoVROCK I 信号通路可能通过其下游效应物 Ez 五 n不仅参与正常子宫内膜的修复,
15、而且参与子宫内膜的异位侵袭、种植,从而促进内异症的发生、发展。RhoGDI 是 Rho 的负调控因子,并且其活性调控与卵巢激素有关研究显示,在内异症患者异位内膜组织中有较高的 RhoGDh 的表达心:日前体外研究证明,妊娠和口服避孕药及高效孕激素通过降调Rhll/ROCK 信号通路从而抑制子宫内膜的收缩,使内异症病灶萎缩而起到治疗的作用 16=也有研究表明,RhoA 和 ROCK I 在内异症异位内膜组织中的表达明显高于正常内膜组织中的表达,并可通过用 Y-272 阻断 Rhll ROCK I 信号通道,降低异位内膜组织的过度纤维化,从而达到治疗内异症的目的。本研究表明,RhoVROCK I 在内异症患者异位、在位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织中均有表达,并且三者之间表达有显著差异,但各组间 RhoA、ROCK I 表达在月经不同周期无变化,因此推测其蛋自表达与月经周期无关,但其活性调控可能受卵巢激素的影响:而因其在位与异位内膜中雌、孕激素受体分布的差涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网 http:/异使异位内膜随月经周期
