《线粒体损伤和二苯胺结构在非甾体类抗炎药引起的肝细胞损伤中的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《线粒体损伤和二苯胺结构在非甾体类抗炎药引起的肝细胞损伤中的作用（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Role of Mitochondrial Dysfunction and Diphenylamine Structure in NSAIDs-induced Hepatocytes InjuryLi yan, Ren jin(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences)Abstract OBJECTIVE: Evaluate the role of mitochondrial function and struc
2、ture of NSAIDs in NSAIDs-induced liver injury. METHODS: The isolated liver mitochondria and primary rat hepatocytes were prepared to perform all the experiments. Diphenylamine was used as a control drug, which had the shared structure of the NSAIDs used in our studies. RESULTS: Diclofenac and tolfen
3、amic acid could induce cyclosporine A (CsA)-sensitive mitochondrial swelling, membrane depolarization and calcium release in isolated mitochondria. However, Diphenylamine had no effects on isolated mitochondria. Dpa, Dcf and Tol all induced mitochondrial dysfunction in hepatocytes, including the dec
4、rease of ATP content and mitochondrial membrane depolarization. CsA could attenuate these effects. Meanwhile, we found that SKF-525A, a nonspecific inhibitor of CYP450, could markedly inhibit the injury induced by Dpa, but not Dcf or Tol. CONCLUSION: Dpa itself could not induce mitochondria injury,
5、the hepatotoxicity induced by Dpa may be related to its metabolism. And the hepatotoxicity caused by diclofenac and tolfenamic acid could attribute to the mitochondrial dysfunction induced by these drugs instead of the effect of the shared diphenylamine structure of these drugs.Key words: Mitochondr
6、ia, liver injury, NSAIDs线粒体损伤和二苯胺结构在非甾体类 抗炎药引起的肝细胞损伤中的作用李妍，任进（药物安全评价研究中心，上海药物研究所，中国科学院，201203）摘要：目的：研究线粒体功能及骨架结构在非甾体抗炎药引起的肝损伤中的作用。方法：采用离体分离得到的线粒体及原代分离的大鼠肝细胞，采用多种分子生物学的方法进行研究。结果：双氯酚酸钠和托灭酸可以导致分离线粒体肿胀，膜电位下降和内钙释放，环孢菌素 A 可以明显的抑制这一过程。二苯胺对分离线粒体则没有作用。在原代肝脏细胞上，三者均可以引起肝细胞线粒体功能损伤，表现为细胞 ATP 含量和线粒体膜电位下降，环孢菌素 A 可
7、以改善这一过程。细胞色素 P450 非特异性抑制剂可以明显的抑制二苯胺导致的肝细胞损伤，而对双氯酚酸钠和托灭酸的肝细胞损伤作用并不明显。结论：二苯胺本身并不能引起线粒体损伤，它导致的肝细胞损伤可能与其代谢有关，而非甾体类抗炎药双氯芬酸钠和托灭酸引起的肝损伤与线粒体功能异常密切相关，而与其骨架结构二苯胺关系不大。关键词：线粒体、肝损伤、非甾体类抗炎药非甾体类抗炎药（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs）具有抗炎、镇痛和退热功效的功效，广泛应用于风湿性疾病如骨性关节炎、类风湿关节炎等慢性关节炎的治疗，是临床应用最广泛的一类药物。全世界将近有 39
8、%的病人使用该类药物1-3。1988 年 11 月到 1991 年 6 月，已经有 180 个案例报道双氯酚酸钠（Diclafenac, Dcf）引起的副作用可能与肝脏损伤有关4。1977 到 1992 年，WHO 记录的 539 起药物副作用反应中，有 384 起与托灭酸（Tolfenamic acid, Tol）有关5, 6。NSAIDs 所引起的肝脏损伤从轻微的胆汁淤积到严重的肝细胞损坏等在临床均有发生7-9。有一些证据表明引发肝损伤的最常见的原因可能是特异体质性疾病并伴随免疫应答症状（如发烧，皮疹和嗜伊红血球增多10-12。近阶段的实验研究在讨论 NSAIDs 引起的肝损伤的机制时，主
9、要集中在氧化应激、代谢活化和线粒体功能等方面13-16。也有些文献关注于 NSAIDs 引起的肝毒性与结构有关17-19。有文献报道 18 种 NSAIDs 对大鼠原代肝细胞的毒性，结果显示细胞毒较明显的NSADIs 中许多具有二苯胺（Diphenylamine, Dpa）的骨架结构。相同浓度的 Dpa 可以引发与 Dcf 和 Tol 相同程度的乳酸脱氢酶的泄漏，Dcf 和 Tol 均含有 Dpa 的骨架结构。因此，Dpa 本身被认为是 Dcf, Tol 等药物产生肝毒性的部分原因17-19。在我们的研究中，着重探讨 Dcf, Tol 引起的线粒体损伤作用是否与 Dpa 的骨架结构有关。我们利
10、用分离得到的大鼠原代肝脏细胞和肝脏线粒体，进而研究三种药物损伤机制的差别。diphenylamineDiclofenac acid tolfenamic acid图图 1 二苯胺（二苯胺（Dpa）以及与其结构相关的化合物双氯芬酸钠（）以及与其结构相关的化合物双氯芬酸钠（Dcf）和托灭酸（）和托灭酸（Tol）的结构式。的结构式。一、材料与方法1、材料和大鼠肝脏线粒体的提取、材料和大鼠肝脏线粒体的提取双氯芬酸钠、托灭酸、二苯胺购自 Sigma，均用二甲基亚砜（DMSO）溶解。 用差速离心方法分离 SD 大鼠的肝脏线粒体20。1mg 线粒体用 1ml 的溶液重悬。将线粒体调整浓度为 1.0 mg 线
11、粒体蛋白/mL，重悬于反应溶液中（210 mmolL-1 mannitol，70 mmolL-1 sucrose，5 mmolL-1 Hepes，PH 7.4） ，30C 孵育，视具体实验要求加入不同浓度钙离子溶液。临实验前，加入 5 mmolL-1 琥珀酸钠溶液激活线粒体。其他具体实验条件详见图表说明。2 线粒体肿胀检测线粒体肿胀检测按 1 中条件孵育线粒体，检测一定时间内，各种作用因素下溶液 A540值的变化，指征线粒体体积变化情况。3、线粒体膜电位检测、线粒体膜电位检测通过测量 TMRE 在线粒体上的聚集程度检测线粒体膜电位的变化。参考 Wu 文献中方法21。1.0 molL-1 CsA
12、 作为 MPT 抑制剂用于该实验中。在激发波长 505 nm，吸收波长535 nm 处检测荧光值。4、原代大鼠肝脏细胞分离、原代大鼠肝脏细胞分离雄性 S.D.大鼠，20020g，两步胶原酶灌流法，分离大鼠肝脏细胞，贴壁培养。将细胞浓度调至 3105 cell/ml，37 oC，5CO2贴壁培养 4 至 6 小时后弃去培养液，加入含15胎牛血清，100 mgL-1青霉素，70 mgL-1链霉素，2 mgL-1两性霉素和 2白蛋白的新鲜培养液（F12/DMEM，1 1混和） ，培养 4 小时后加入不同浓度的药物。5、细胞存活率检测、细胞存活率检测 原代大鼠肝细胞用双氯芬酸钠，托灭酸和二苯胺处理，细
13、胞存活率用Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)检测。6、细胞、细胞ATP生物荧光检测生物荧光检测ATP生物荧光试剂购自CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability 试剂盒(Promega, MadiMadison,WI, USA)。胞内的ATP水平根据试剂盒的要求测定。生物发光用荧光仪读取荧光值 (NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany)。7、细胞线粒体膜电位的检测、细胞线粒体膜电位的检测用荧光探针TMRE检测细胞中线粒体膜电位的检测。
14、膜电位的变化用荧光酶标仪仪（NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany）检测，激发波长为505 nm，发射波长为535 nm。8、统计分析、统计分析所有数据用均数标准差（meanSD）表示，数据计量资料用 SPSS 11.0 统计软件进行单因素方差(ANOVA)分析，P0.05 示差异有统计学意义。二、结果1. Dpa, Dcf, Tol 对大鼠肝脏线粒体功能的影响对大鼠肝脏线粒体功能的影响1.1 相同浓度 Dpa, Dcf, Tol 对大鼠肝脏线粒体肿胀的影响在钙离子存在的情况下，Tol 能够引起线粒体大幅度的肿胀，Dcf 则引起中等程度的肿胀，而 D
15、pa 不能引起线粒体肿胀，MPT 特异性抑制剂环孢霉素(cyclosporin A, CsA)可以完全抑制 Dcf 和 Tol 引起的线粒体肿胀(图 2A)。同时，Dpa 对线粒体膜电位几乎没有影响，而 Dcf 和 Tol 均能使线粒体膜去极化，导致膜电位下降(图 2B)。CsA 可以保护 Dcf 和 Tol所引起的线粒体去极化现象。AB图图 2 Dpa, Dcf, Tol 对大鼠肝脏线粒体的影响。对大鼠肝脏线粒体的影响。(A)Dpa, Dcf 和 Tol 对大鼠肝脏线粒体肿胀 的影响。(B) Dpa, Dcf 和 Tol 对大鼠肝脏线粒体膜电位的影响。各组均为 20molL-1Ca2+存 在
16、的条件。所有结果均至少重复三次。*P0.5 和 *P0.01 表示与对照差异显著。#P0.01 表示不加 CsA 组与加 CsA 组差异显著。+P0.05 和+P0.01 表示与 50molL-1Dpa 差异显著.1.2 相同浓度 Dpa,Dcf,Tol 对大鼠肝脏线粒体内钙释放的影响我们检测了 Dpa,Dcf,Tol 对线粒体内钙释放的影响。Dcf 可以引起大鼠肝脏线粒体的内钙释放，1molL-1 CsA 可以抑制该现象的发生。但是 Dpa 和 Tol 无法引起线粒体的内钙释放(图 2)。图图 3 Dpa, Dcf, Tol 对大鼠肝脏线粒体内钙释放的影响。对大鼠肝脏线粒体内钙释放的影响。各组均为 20molL-1 Ca2+存在 的条件。值以平均数标准差的形式表示。所有结果均至少重复三次。*P0.01 与对照有 显著差异。#P0.01 与不加 CsA 组有显著差异。+P0.01 与 50molL-1 Dpa 有显著差异
