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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 及相关生长调控基因在胃癌组织中的表达及及相关生长调控基因在胃癌组织中的表达及意义意义作者：李静 朴云峰 安鼎伟 金丽君 陈丽 作者单位：吉林大学第一医院消化科，吉林 长春 130021【摘要】 目的 探讨转录信号传导子与激活子 3(STAT3)及相关生长调控基因在胃癌发生发展中的作用及意义。方法 应用 RT-PCR 检测 STAT3 基因及相关基因 c-myc，p53，生存素(survivin)，血管内皮生长因子(VEGF)的 mRNA 表达水平，应用 Western 印迹法及免疫组化法检测 STAT3 基因的蛋白水平及定位表达。结果 胃癌组织及癌旁组
2、织中 STAT3 mRNA 的表达均明显高于正常胃组织(P0.01)，胃癌及癌旁组织中 c-myc，survivin，VEGF mRNA 的表达上调(P0.01)，p53 mRNA 的表达下调(P0.01)，胃癌组织及癌旁组织中 STAT3 蛋白水平的表达均高于正常胃组织(P0.01)。结论 STAT3 基因的持续激活在胃癌的发生发展中起重要作用，可作为早期诊断的指标及治疗的靶点。【关键词】 STAT3;胃癌;基因转录信号传导子与激活子 3(STAT3)是 STAT 家族的重要成员，其所参与的信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化1 。已有研究
3、证实 STAT3 的酪氨酸磷酸化，即信号依赖的活化形式，在多种肿瘤中普遍存在，并在某些肿瘤中发挥重要作用2 。目前有关 STAT3 的KKME-专业医学搜索引擎 http:/ STAT3 在消化系统疾病中的研究尚不多见，国内的研究3，4多侧重 STAT3 在胃癌组织中和胃癌细胞中的阳性表达及临床意义等，国外的研究5，6多侧重于各种细胞因子包括白细胞介素-6(IL-6)、DIF、VEGF 等对 JAK/STAT 信号通路中STAT3 活性的影响。本研究拟通过检测 STAT3 基因在人胃癌组织中基因及蛋白水平的表达，同时检测相关生长调控基因 c-myc，p53，生存素(survivin)，血管内皮
4、生长因子(VEGF) mRNA 水平的表达，探讨 STAT3 基因异常在胃癌发生发展中的作用及可能的机制。1 材料与方法1.1 病例资料 15 例均为住院病人(吉林大学第一医院 2005年 9 月2006 年 12 月)，经胃镜及黏膜活检病理定诊，均行胃癌切除术，术后病理证实为胃癌。男 10 例，女 5 例，年龄 6074(平均65)岁。1.2 标本来源 新鲜胃癌术后组织包括正常胃组织、癌旁组织、胃癌组织，部分液氮保存，待提取 RNA 及蛋白，部分福尔马林固定，石蜡包埋，待免疫组化染色。1.3 主要试剂及仪器 Anti-P-STAT3 兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自 Sa
5、nta Cruz 公司，Anti-STAT3及 SABC 组化试剂盒购自武汉博士德公司。Trizol 购于北京鼎国公司，RT-ACE 购于 Invitrogen 公司，Taq DNA 聚合酶购于 GenomyKKME-专业医学搜索引擎 http:/ 仪(SONY,Japan),电泳仪(Bio-Rad,USA)，蛋白质电泳转膜仪(Bio-Rad,USA)。1.4 实验方法1.4.1 免疫组化法 按说明书操作。阳性结果为细胞浆或胞核棕黄着色，随机选取 5 个高倍镜视野，计数阳性细胞占所研究细胞的 15%以上即为阳性。1.4.2 RT-PCR 法 液氮保存组织常规提取 RNA，紫外分光光度计法定量后
6、取 10 g 总 RNA 逆转录为 cDNA，PCR 条件：94 5 min;94 30 s，56 30 s，72 45 s，30 个循环;72 7 min,同时检测 c-myc、p53、survivin、VEGF，以 -肌动蛋白(-actin)为内参。PCR 产物以 2%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，应用天能 Gis 凝胶成像系统分析，PCR 产物量以光密度/面积表示，以 STAT3 产物量/-actin 产物量的比值为最终结果，实验重复三次。引物序列：STAT3：正义引物 5TTGCCAGTTGTGGTGATC 3，反义引物5AGACCCAGAAGGAGCCGC 3;-actin：正义引物5
7、AAGTACTCCGTGTGGATCGG 3 ,反义引物5ATGCTATCACCTCCCCTGTG 3;c-myc：正义引物5CTGCTGCCAAGAGGGTCA 3，反义引物5CGTTTCCGCAACAAGTCC 3;VEGF：正义引物 5 AAAGGAGCCTACAAGA 3，反义引物 5 TTCACAAGCAGCCAAT 3;p53：正义引物KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3，反义引物 5 CACAAACACGCACCTCAAA 3;survivin:正义引物5GAATTCATGGGTGCCCCGACCTTGCC 3，反义引物5AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTT
8、CC 3,引物均由上海生工公司合成。1.4.3 Western 印迹法 液氮保存组织常规提取蛋白，应用Bio-Rad 标准曲线蛋白定量，40 g 总蛋白加入等体积的 2上样缓冲夜混匀后煮沸变性 5 min，蛋白分离电泳采用 12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳后采用半干法转膜至 PVDF 膜，Anti-P-STAT3 兔抗人多克隆抗体浓度 1200，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗浓度 12 000，显色应用 DAB。应用天能 Gis 凝胶成像系统分析，蛋白量以光密度/面积表示，以 STAT3 蛋白量/-actin 蛋白量的比值为最终结果,实验重复三次。1.5 统计学方法 应用 SPSS1
9、2.0 软件行相关数据分析，计量资料采用 xs 表示;两组均数的比较用 t 检验。2 结果2.1 STAT3 基因及相关生长调控基因的 mRNA 表达水平 胃癌、癌旁、正常组织中均有 STAT3 基因表达，PCR 产物量STAT3/-actin 的比值(%)分别为72.662.02，71.202.60，32.602.30，胃癌、癌旁组织中的表达显著高于正常组织(均 P0.01)。同时检测的 c-myc，survivin，VEGF基因在胃癌、癌旁、正常组织的 PCR 产物量/-actin 的比值分别为KKME-专业医学搜索引擎 http:/ P0.01)，p53 基因在胃癌、癌旁、正常组织的 P
10、CR 产物量/-actin 的比值分别为36.650.30，44.840.54，86.340.73，胃癌、癌旁组织中的表达显著低于正常组织(均 P0.01)。2.2 STAT3 基因的蛋白水平的表达 Western 印迹法检测所有标本均有 STAT3 基因蛋白的表达，但正常组织中表达较弱，癌组织中表达最强，癌旁组织次之。STAT3 蛋白量/-actin 蛋白量的比值(%)分别为 77.645.44，73.194.42，34.241.10，经 t 检验分析,胃癌、癌旁组织中的表达与正常组织相比有显著性差异(均 P0.01)。免疫组化检测 15 例标本中 7 例癌及癌旁组织有 STAT3 基因蛋白
11、的表达，阳性率为 46.67%。正常组织中有 2 例呈弱阳性表达。STAT3蛋白以胞浆表达为主，磷酸化 STAT3 蛋白以胞核表达为主。见图1。图 1 免疫组化检测 STAT3 蛋白的表达(略)3 讨论STAT3 于 1994 年作为 IL-6 信号传递中的急性反应因子被发现并被纯化7 ，且越来越多的证据支持 STAT 家族在肿瘤形成过程中起重要作用，尤其是 STAT3 和 STAT5 810 。酪氨酸磷酸化是 STAT3 的活化形式，持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化。尽管有关 STAT3 的研究主要集中于白血病、多发骨髓瘤、乳腺KKME-专业医学搜索引擎 http:/ STAT3 在胃癌
12、中的研究提示 STAT3 的异常活化与胃癌的发生发展密切相关。Jenkins等11研究显示高度激活的 STAT3 可以关闭肿瘤细胞生长的关键调节因子肿瘤生长因子 -(TGF-)的表达，从而导致肿瘤的发生，首次确认了胃癌与 STAT3 信号通路之间的联系，将 STAT3 确定为胃癌治疗的一个新的靶点。Yakata 等12应用免疫组化法检测111 例胃腺癌组织，p-STAT3 的阳性率为 49.5%，而且与临床病理因素密切相关，阳性病例预后不良，因此认为 STAT3 的组成性激活在胃腺癌的发生中起重要作用。Jackson 等13在研究幽门螺杆菌相关性胃癌发生机理中，发现幽门螺杆菌相关性胃炎中 ST
13、AT3 和ERK1/2 表达明显增高，幽门螺杆菌感染后 IL-6 表达增高，而在胃癌组织中 IL-6 和白细胞介素-11(IL-11)表达均明显上调，IL-11 的高表达与腺癌的发生相关，可能的机制是通过促 STAT3 活化导致细胞增殖。本研究证实在人胃癌及癌旁组织中存在 STAT3 基因的高表达，包括转录水平的增高及蛋白表达水平的增高，与正常胃组织有显著差异，提示 STAT3 的异常激活可能发生在胃癌的早期。生理情况下，无活性的 STAT3 存在于胞浆中，接受信号刺激后形成磷酸化STAT3，进入胞核启动下游基因转录，随即降解，我们同时检测了磷酸化 STAT3 蛋白的表达，发现其在胞核中大量表
14、达，支持STAT3 的持续磷酸化可能是引发细胞恶性转化的重要环节。同时检测的 c-myc、 survivin、VEGF 基因被认为是 STAT3 基因的下游基KKME-专业医学搜索引擎 http:/ p53 基因mRNA 在胃癌及癌旁组织中的表达低于正常胃组织。c-myc 为细胞增殖及凋亡双向调节因子，当促癌因素为主时表现为促进细胞增殖作用;survivin 为凋亡蛋白抑制因子，在凋亡和细胞周期的基因调控中发挥重要作用14 。本组结果显示 survivin 在正常组织中无或微弱表达，在癌旁组织中弱表达，在癌组织中强表达，提示其为癌变晚期指标;VEGF 是强效力的促血管生成因子，可促进肿瘤的血管
15、生成，与肿瘤的发生发展及转移关系密切15;p53 基因是重要的促凋亡因子，有报道 STAT3 在体内及体外实验中均可与 p53 启动子结合，其 DNA 结合位点的特异性突变可影响 p53 基因的活性16 。据此推断在胃癌的发生发展过程中，STAT3 的异常增高及持续磷酸化，可启动其下游基因的持续活化，并阻断了某些重要抑癌基因的活性，其致癌机制为促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促血管生成而加快转移。因而 STAT3 基因可望成为胃癌的诊断指标及治疗的靶点。【参考文献】1 Hoey T，Grusby MJ.STATs as mediators of cytokine-induced responseJ.Adv Immunol,1999;71:145-62.2 Korty
