电泳在生物分离工程中的应用

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1、电泳在生物分离工程中的应用电泳在生物分离工程中的应用我们将在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electropho- resis） 。我国的电泳技术发展起步并不是很晚，尤其是在世纪 60-70 年代，当滤纸、聚丙烯酰 胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分 广泛。 1 2 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞 的研究。随着电泳技术的逐步发展，种类不断增加，现在它已广泛地应用于分析化学、生物化 学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。由于生物分离中 涉及多

2、种物质的不同性质，对分离有多种限制，所以电泳的优点在生物分离中应用的淋漓尽致。 本文章通过对电泳的最新发展在生物分离工程中的应用和未来的发展前景加以综述。 根据不同的分离标准可以将电泳划分为不同的种类。按分离原理可分为界面电泳、区带电泳、 等电聚焦电泳和等速电泳。 界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极） ，在电泳开始 前，样品与载体电解质有清晰的界面。 区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用 下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区 带。 等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有 pH

3、梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等 电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正 极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电 点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。 等速电泳是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移 率比所有被分离离子的小） ，样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行 移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在 领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载

4、带电流 ，所得到的区带 是相互连接的，且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。 另外，按照是否有固体支持物分类，可分为自由电泳和支持物电泳两类。自由电泳又可以分为 （1）显微电泳（也称为细胞电泳） ，是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；（2）移界电泳； （3）柱电泳，实在层析柱中进行，可利用密度梯度的差别使分离的区带不再混合，如再配合 ph 梯度，则为等电聚焦柱电泳；（4）自由流动幕电泳；（5）等速电泳等。支持物电泳是多种 多样的，也是目前应用最多的一种方法。其电泳过程可以是连续的也可以是不连续的（分批） ， 可进行常压电泳，高压电泳，免疫电泳，等电聚焦电泳及等速电泳。

5、 3 56 如果在考虑到电泳槽的形式也是多种多样的，有垂直的，水平的，柱状的，毛细管的，湿小室 及幕状的。由上可见电泳种类很多，电泳的基本原理相同，但不同的支持物或凝胶又不同。现 在将在生物分离工程中应用比较广泛的几种方法介绍如下： 双向电泳（又称为二维电泳）：二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白 质等电点进行分离）以及 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离） 。这两 项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。 通常第一维电泳是等电 聚焦，在细管中（13 mm）中加入含有两性电解质、8M 的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯 酰胺凝胶进行等电聚

6、焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出， 用含有 SDS 的缓冲液处理 30 min，使 SDS 与蛋白质充分结合。 将处理过的凝胶条放在 SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。 在第二维电泳过程中，结合 SDS 的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入 SDS聚丙烯酰胺凝胶，在浓 缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出 10002000 个蛋白质， 有些报道可以分辨出 500010000 个斑点，这与细胞中可能存在的蛋

7、白质数量接近。由于二维 电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。 3 6 等电点聚焦电泳：等电聚焦（Isoelectric focusing，简称 IEF）是六十年代中期出现的新技 术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前 等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差 0.001pH 单位的生物分子。由于其分辨力高，重复 性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应 用。在 IEF 的电泳中，具有 pH 梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。如前所述， 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特

8、征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动， 直至某一 pH 位点时失去电荷而停止移动，此处介质的 pH 恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点 （pl） 。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有 pH 梯 度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的 pH 位置上， 形成分离的蛋白质区带。常用的 pH 梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶 等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。 4 毛细管电泳：毛细管技术是一类以毛细管为分离通道、以高压

9、直流电场为驱动力，根据样品中 各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于 80 年代 中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后 的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分 析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展 最为迅速的领域之一。 1 5 毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析， 以两个电解槽和与之相连的内径为 20100m 的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管 柱，在 pH3 的情况

10、下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下， 形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带 电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速 度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差 异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁 移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不 同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。 目前已有多种灵敏度很高的检

11、测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV） 、激光诱导 荧光检测器（LIF） 、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD） 。由 于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性， 影响分辨率。 7 我国的电泳技术虽然起步不算太晚，现在实验室中仍采用较落后的设备。随着科技的不断进步， 电泳技术也在不断的更新和发展，相信会有功能更加详细的技术出现，必将促进生物分离的发 展。 参考文献：1生物化学实验原理和方法，李建武等，北京大学出版社，2004 2 生物分离工程，孙彦，化学工业出版社，2005 3 生物化学，王镜岩，高等教育出版社，2002 4电泳技术的发展与应用 张涛 吴刚 李丽娜 刘扬包头医学院学报 2007 年第 23 卷第 5 期 5电泳技术的现状和发展 沈霞 中华检验医学杂志 2001 年 9 月第 24 卷第 5 期 6双向电泳技术原理及其应用 刘上峰 傅俊江国外医学生理病理科学与临床分册 2002 年 4 月 第 22 卷第 2 期 7脉冲电泳技术及其应用岳慧琴 2007 年第 5 期 LABORATORY SCIENCE 2007 年 10 月