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1、水体污染物对淡水贝类抗氧化系统的影响一、实验目的：一、实验目的：重金属以及化学农药(除草剂)残留和多化芳烃等有机污染是造成我国淡水水体污染的主要污染物。贝类属于敏感型底栖生物，对水质的要求比较高。可作为水环境污染物危害的指示物。同时，生物体内抗氧化酶活力的高低可反映机体的抗病力。本实验拟采用酶分析法探讨水体污染物对淡水贝类抗氧化系统及主要抗氧化酶的影响。对培养学生从事水生生物免疫学研究具有重要的指导意义。二、实验原理：二、实验原理：水体污染可对贝类造成氧化胁迫，产生大量的活性氧族（ROIS） ，ROIS能诱发贝类的抗氧化防御系统对其作出应激反应。抗氧化系统的变化情况反映了机体免疫力的高低。通过
2、测定实验蚌抗氧化系统的主要指标（SOD 活性、CAT 活性、GPX 活性、GSH 含量、ROS 含量）和半定量检测主要抗氧化酶（SOD、CAT、GPX）的表达变化，研究各种胁迫条件下淡水蚌的敏感指标，用于诊断环境污染以及评价污染物对淡水蚌的毒性效应。三、仪器、设备、及试剂：三、仪器、设备、及试剂：冷冻离心机1台，碾砵 10个，起蚌器 5只，分析天平2台（0.01g） ，液氮罐 1个，分光光度计1台、匀浆器、剪刀、镊子、1mL注射器、10ml的离心管、水族箱或塑料框（50L）8个、充氧泵 4个、联苯胺 25g、考马斯亮蓝G-250（分析纯）25g、牛血清白蛋白（分析纯）25g、硫代巴比妥酸 （分
3、析纯）10g、30% 的H2O2 （分析纯） 、500ml 1瓶、正磷酸 500ml，1瓶、谷胱甘肽 (GSH)测定试剂盒 100次/盒 ，南京建成生物公司；3个；谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒100次/盒，南京建成生物公司；3个； 10ml注射器、100支，10ml离心管、100支10ml试管、100支，100ml烧杯、 2个，500ml，2只；1000ml，2只，容量瓶500ml,100ml 各2个；广口瓶1000，2000ml各2个，匀浆器 10ml 30支；移液枪 1mL, 100L, 5mL支 各一支。 水浴锅，一台四、实验内容四、实验内容内容一、重金属和有机污染物对褶纹冠蚌的胁迫内容
4、一、重金属和有机污染物对褶纹冠蚌的胁迫 （8 课时）课时）1、仪器、仪器试剂和设备试剂和设备PH 计、量筒、烧杯、滤纸，硫酸锌或硫酸铜、苯酚或联苯胺、水族箱、充氧泵2、方法、方法选择壳长为(9.661.07)cm、壳高(6.580.85)cm 的健康蚌，在水族箱中暂养一周以上，水温控制在 20、PH 6.8-7.0，保持水中通气(连续冲气暂养)，每天换水一次。将 120 只褶纹冠蚌随机分成 6 组，每组 24 只，其中一组作为对照，不加入其他任何物质，其他 5 组用于实验，实验组中 3 组分别加入重金属（铅或锌）使终浓度为 2mg/L（高浓度组） 、1mg/L（中浓度组） 、0.5mg/L（低
5、浓度组） ，两组加入有机污染物（联苯胺或苯酚）使终浓度为（高浓度组） 、低浓度组。各种缓冲液的配制。内容二、酶原液的提取内容二、酶原液的提取（8 课时）课时）1、仪器、仪器试剂和设备试剂和设备注射器，离心管、阿氏液、天平、离心机等2、血清样品的制备、血清样品的制备 重金属和有机物胁迫后，在 0、12、24、48、72、96h 分别用 2.5mL 注射器 5 号针头从对照组和实验组蚌闭壳肌血窦中取血约 1.5mL, 每个时间段每组取 4 只，以 3600 rmin 的转速低温(4)离心 10min，移出上清液，获得实验所用血清样品，置于 4冰箱中备用。 3、肝胰脏提取液的制备、肝胰脏提取液的制备
6、 蚌取血后，取出适量肝胰脏，滤纸吸干水分后称重，加入无菌生理盐水(0.9%)于冰浴中匀浆，使浓度达到 01 gm L，在 4条件下，以 3000 rmin 离心 l0 min，除去沉淀后获得蚌的肝胰脏组织提取液，并以其作为酶原液进行酶活性测定，置于 4冰箱中备用。内容三、蛋白浓度的测定内容三、蛋白浓度的测定 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 比色法比色法（8 课时）课时）1. 目的目的学习和掌握考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理和方法。2、 原理原理考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝 G-250 是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸
7、收波长为464nm。由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为 595nm。这种结合在 2 分钟左右达到平衡，生成的复合物在 1 小时内保持稳定。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在 595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为 5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。3、实验材料及设备
8、、实验材料及设备（1）材料褶纹冠蚌肝胰脏提取液（2）仪器分光光度计 离心机 电子天平（3）器材刻度试管： 25mL9 刻度试管： 10mL1 移 液 管： 1mL3 20mL1烧 杯： 250mL2 50mL1 离 心 管： 10mL1 滴 管： 2洗 耳 球： 2 坐 标 纸 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 14、试剂的配制、试剂的配制1. 牛血清白蛋白(BSA)标准液（100mg/mL）精确称取 10mg 牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至 100mL。2. 考马斯亮蓝 G-250 染色液取 0.10g 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL 95%的乙醇中，加入 100mL 85
9、%的正磷酸，再用蒸馏水定容到 1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存 1 个月。5、 操作步骤操作步骤1. 样品液的制备按内容 2 肝胰腺样品制备 2. 标准曲线制作及样品测定取 9 支试管，按下表所示顺序操作。6、结果处理1. 由 05 号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595 为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，标准曲线的相关系数必须达到 0.95 以上；2. 求样品管 A595 的平均值 A595；3. 由平均值 A595 从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)；4. 计算每个样品中蛋白质的含量（单位用 mg/g 鲜重） 。内容四、内容四、CAT 活性测定（氮蓝四唑法）
10、活性测定（氮蓝四唑法） （8 课时）课时）1、原理、原理 在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性物质 ，SOD 通过催化歧化反应，生成 O2与 H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的 50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制 50%蓝色形成所需酶量越少。 2、仪器、仪器 荧光灯管、离心机、分光光度计、PH 计。 3、试剂、试剂 （1）磷酸氢二钾（K2HPO43H2O） ，磷酸二氢钾（KH2PO4） ，甲硫氨酸（L-Met） ，氮蓝四唑（NBT） ，核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA-N
11、a2） ，以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。 （2）pH7.8, 5.010-2mol/L 的 K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存） 。 试剂配制：（1）：0.05mol/L 的 PBS, PH=7.8（2）130mmol/L L-Met: 1.9399g L-Met 用 PBS 定容至 100ml.（3）750mmol/L NBT: 0.06133g 用 PBS 定容至 100ml.(避光保存)（4）100mol/L EDTA-Na2：0.03721g 用 PBS 定容至 1000ml.（5）20mol/L 核黄素：0.0753g 用蒸馏水定容至 1000m
12、l.4、测定步骤、测定步骤 （1）酶液的制备：同上，测定血清和肝胰腺的 SOD 活力。 （2）酶反应酬体系液的制备：加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml，L-Met（甲硫氨酸）: 0.3ml, NBT（氮蓝四唑）: 0.3ml, EDTA-Na2, 0.3ml, 核黄素，0.3ml, 酶液，0.05ml, 蒸馏水：0.25ml，放冰箱中避光保存。 （3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液 3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入 2530L 酶液。在 2530下用光强 4000lx 的荧光灯管（可用
13、15W 荧光灯）进行光照，1520min 后，出现颜色变化。停止光照。在 560nm 波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。 5、结果计算、结果计算 以抑制蓝色形成的 50%为一个酶活单位。按下式计算： 式中 s样品照光后的透光度； a未加酶之反应液照光后透光度； b未加酶之反应液照光前透光度； n酶液稀释倍数。 样品酶活单位表示：SOD 酶活单位（U）/g 干重（g 鲜重或 g 蛋白） 。 6. 注释 （1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。 （2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定 A560 值。2
14、、MDA 的测定的测定试剂配制：（1）：5% TCA(三氯乙酸), 5g 用蒸馏水定容至 500ml.（2）0.5% TBA(硫代巴比妥酸): 2.5g 用 TCA 定容至 500ml.方法：酶液 1ml3ml0.5%TBA 混合后在 100 度水浴煮沸 15min迅速冷却，10000r/min 离心 10min用蒸馏水调零分别测定上清液在 532nm、600nm 处的吸收值内容五、内容五、SOD 活性测定活性测定 （8 课时）课时）1、目的、目的了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算2、原理、原理过氧化氢酶（Catalase，CAT，E
15、C 1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除 H2O2的重要酶之一，其催化的反应为：通过上述反应，CAT 可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。传统测定 CAT 活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优点。测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于 H2O2 在 240nm 处有吸收峰，加入酶液后会使 A240 下降，而 A240 下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算
16、A240 的变化速率 DA240min-1，最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240min-1g-1Fw 并以此来表示样品中 CAT 活力的大小。3、实验材料及设备、实验材料及设备1. 材料上述制备的血清和肝胰腺匀浆液2. 仪器电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计3. 器材刻度试管、 移 液 管、微量进样器、塑料离心管、小 试 管 滴 管 洗 耳 球 、 硫 酸 纸4、试剂的配制、试剂的配制试剂配制：(1) 50mmol/L 的 PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O21ml H2O2定容至 100ml5、操作步骤、操作步骤1. 粗酶液的制备略2 酶活力测定(1) 紫外分光光度计与记录仪相连接，波长定于 240nm 处，记录仪的量程定于 50mV 处，预热 10min，仪器调零。(2)以不加 H2O2的 50mmol/L 的 PBS（pH7.0）为空白把 A
