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1、淋球菌外膜蛋白 N spA 基因重组子的 构建与表达【摘要】 目的： 构建淋球菌标准株外膜蛋白 N spA 基因重组子, 在大肠杆菌 BL 21 (DE3)中诱导表达外膜蛋白 N spA。 方法： 提取淋球菌标准株基因组 DNA , PCR 扩增其 N spA 基因, 插入表达质粒载体 pET -30c (+ )中, 构建 pET-N spA 重组子, 转化 表达宿主大肠杆菌 BL 21 (DE3) , 异丙基-表达宿主大肠杆菌 BL 21(DE3) , 基因型为 h sdSgal ( c I t s857 indl Sam 7 n in L acUV 52T 7) , 原核表达质粒载体为 p
2、ET 230c (+ ) , 均为本实验室保存2. 主要试剂Taq P lu s DNA 聚合酶(北京天为时代科技有限公司)、 dN TP m ix tu re (各 2 . 5 mmo l L )、琼脂糖(西班牙进口分装)、 T r is base (U SA 进口分装)、SDS ( GI BCO )、 EDTA ( B i o2 Rad )、 硼 酸(AMRESCO 分装)、 DNA marker 、 (北京天为时代科技有限公司)、 PCR 产物纯化试剂盒(离心柱型) (北京天为时代科技有限公司)、 S ac、 H ind (MB I )、 DNA L igat i on Kit ( Ta
3、KaRa )、IPTG(BB I)、 引物合成(上海英俊生物技术有限公司)、 大 量质粒快速抽提纯化试剂盒(Omega)、 小量质粒快速抽提纯化试剂盒(Omega)、 丙烯酰胺 (M erck )、TEM ED (AMRESCO )、 2 巯 基 乙 醇 (Co lnb rookBuck s England )、过 硫 酸 铵 ( Sino2 Amer icanB i o tec)、 PVDF 膜(0 . 45 m, Invit rogen )、 H is2Tag单克隆抗体(Novagen) , 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG (H+ L ) (北京中杉金桥生物技 术有限公司)、 其余试
4、剂(国产分析纯)。 3.方 法1 N spA 重组子的构建（1） 淋球菌基因组 DNA 的提取 转种所保存淋球菌标准株 29403 于巧克力琼脂平板上, 5%CO 2, 36 , 培养 24 48 h, 生 理盐水洗下菌苔, 收集菌体, 参照 L ew ington 等8 的方法提取基因组 DNA ,最后溶于灭菌 水, - 20 保存备用。 （2）N spA 目的基因的获得 根据 GenBank 中 N spA 序列分析, 自行设计引物, 序列特点见附表。PCR 扩增体系为: 模板 DNA 16 40 ng、 10Taq P lu s Buffer、2 mmo l L M gCl2、0 . 2
5、 mmo l LdN TP、 0 . 25 U pfu 酶、 0 . 5 mo l L 上下游引物、 反应总体积50 L。扩增条件如下: 95 预变性 3m in,95 变性 1 m in, 60 退火 1 m in, 72 延伸 1 . 5m in, 30 cycles, 72 延伸 7 m in。产物于 1 . 5%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察。将 PCR 产物用 S ac 和 H ind 进行双酶切, 1 . 5%琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收目的 片断。 （3）载体 pET 230c (+ )的制备 大量提取质粒 pET 230c (+ ) , 用 S ac 和 H ind 双酶切
6、后, 小牛肠碱性磷酸酶(C I A P)去 磷酸化, 1 . 0%琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收质粒载体。 （4）重组质粒的构建 将经酶切、 纯化后的 PCR 产物和 pET 230c (+ )载体按合适的摩尔数比进行连接后, 转化 克隆宿主大肠杆菌 DH5 和表达宿主菌 BL 21 (DE3)。所得重组质粒用 S ac 和 H ind 进 行双酶切鉴定。并经 AB I 3730 全自动 DNA 测序仪对所得重组子 N spA 基因序列进行测 序(上海博亚公司完成)。2 N spA 重组蛋白的诱导 将鉴定过的阳性克隆菌落转种到含 30 g mL Kanamycin 的 LB 琼脂平板上划线
7、分离, 37 , 220 r m in 培养过夜。取单 个 典 型 菌 落 转 种 于 110 mL 含 30 g mLKanamycin 的 LB 肉汤, 37 , 220 r m in 振荡培养至 A 600 达到 0 . 6 左右; 无菌分装 为两瓶后, 一瓶加入 IPTG 至终浓度 1mmo l L , 另一作为对照组。 分别在 0 . 5 h、 1 h、 2 h、 3 h、 4 h 时收集实验组和对照组的培养液各 1 mL , 离心收集菌体沉淀, 溶于 100 L 无菌水中, 加入 100 L 2SDS2 PA GE 样品缓冲液, 混匀后- 20 保存。3 N spA 重组蛋白的检测
8、（1） SDS2 PA GE 检测 采用 L eamm li 系统,配制 12% (w v, 丙烯酰胺在凝胶中的百分比)分离胶, 5% (w v, 丙烯 酰胺在凝胶中的百分比)浓缩胶;取出- 20 保存的样本, 沸水浴 5 m in, 10 L 孔,趁热上 样, 5%浓缩胶 120 V 电泳 30 m in, 12%分离胶 80 V 电泳 3 h。考马斯亮兰染液染色 30m in, 脱色液脱色 4 6 h 至出现清晰条带, 观察结果。 （2） W estern B lo t 检测 12% SDS2 PA GE 凝胶电泳后, 用 DYCZ240D 转移电泳槽(北京六一仪器厂) , 全湿法将蛋 白
9、转移到 PVDF 膜上(恒定电流 80mA , 2 h) , 加入封闭液 含 5%脱脂牛奶的 T r is 缓冲盐水(TBS) , 37 , 轻摇孵育 1 h, 加入小鼠源性 H is2Tag 单克隆抗体(12000) , 37 , 轻摇孵育 1h, 以含 0 . 1% Tw een 20 的 TBS (TBST )洗膜三次 (10 m in 次)后, 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗 小鼠 IgG (H+ L ) (110 000) , 37 , 轻摇反应 1 h,以 TBST 洗膜三次(10 m in 次)后,DAB 显色液显色 10 m in 左右, 以 PBS 终止显色反应, 观察结果。
10、 二：结果1 N spA 目的基因的获得淋球菌标准株 29403 经过 PCR 扩增后, 在 500bp 左右处出现产物条带, 片段大小和预期 产物大小相符, PCR 扩增所得产物命名为 N G2294032 N spA(图 1)。图 1 NG-29403-NspA 电泳结果2 pET-NspA 重组子的鉴定从卡那霉素平板上随机挑选单个白色菌落, 提取质粒, 经 S ac 和 H ind 双酶切, 凝胶电 泳显示,分别得到符合载体长度(5 . 4 kb)和符合预期 N spA 长度(464 bp )的目的基因片断, 提 示重组子构建成功(图 2)。扩增所得重组子命名为 pET 2 N G229
11、4032N spA。3 淋球菌外膜蛋白 N spA 基因的序列测定重组子 pET 2 N G2294032 N spA 的 N spA 基因经过测序, 全长为 467 bp , 结合载体序列 进行分析, 确定其开放读码框架正确, 所得克隆序列共编码 157 个氨基酸。与 GenBank 中所报道的淋球菌 FA 1090 株 N spA 基因序列进行同源性比较, 同源性高达 99% ,仅存在一个碱基位点的差异, 即在第 399 位, 淋球菌 FA 1090 为碱基 G, 标准株 29403 则为碱基 A; 与国内季明春等7 提交的淋球菌 WHO 2 A 的 N spA 基因序 列同源性为 98%
12、 , 其中于 158 位点处插入了三个碱基 CAA。4 pET-NspA 重组蛋白的诱导表达与检测含重组子大肠杆菌的 IPTG 诱导组和无 IPTG 诱导组的菌体经 SDS2 PA GE 电泳, 考 马斯亮兰染色分析后显示, 在 0 . 5 h、 1 h、 2 h、 3 h、 4 h 时, 诱导组菌体蛋白于相对 分子质量在 20 . 1103 31 . 0103 间, 较对照组出现明显诱导条带, 所得融合蛋白的相 对分子质量大小与预期基本相符, 见图 3。W estern B lo t 结果显示, 在 SDS2 PA GE 上出现的明显诱导条带(相对分子质量约24103 处)可被 H is2Tag 单克隆抗体识别(图 4) , 说明该融合蛋白带有 H is2Tag; 与此同 时, 在相对分子质量约为 20103 的位置上也出现一条阳性带, 经分析, 此带可能为融合蛋 白的降解条带。
