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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响响作者：芮理，薛万江，李鹏，王鹏，王志伟，李厚祥 作者单位：南通大学附属医院普外科，南通 226001【摘要】目的：研究 RASSF1A 提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用。方法：通过脂质体介导的基因转染法将 RASSF1A 基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株 QGY-7703，G418 筛选稳定表达株，并以 RT-PCR 和 Western Blot 进行鉴定目的基因的表达。化疗药物阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺
2、铂(DDP)分别作用各细胞株后，检测各细胞株的生长抑制率。结果：经 800 g/ml 的 G418 最佳筛选浓度筛选QGY-7703 细胞株，成功建立稳定表达 RASSF1A 基因的肝癌细胞株。以 QGY-7703 细胞为对照，MMC 对表达 RASSF1A 基因的肝癌细胞的生长抑制率最大为 21%。结论：RASSF1A 基因的表达可明显提高肝癌细胞对 MMC 的敏感性。RASSF1A 的表达不影响肝癌细胞QGY-7703 对 ADM、 VP-16、5-FU 和 DDP 敏感性。【关键词】 肝细胞癌 Ras association domain family 1A 药物敏感性 逆转录聚合酶链反
3、应Effects of RASSF1A gene expression on the chemosensitivity of human hepatocellular carcinoma cellRUI Li, XUE Wanjiang, LI Peng, et al (Department of General KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)Abstract Objective：To investigate the effects of RASSF1A gene e
4、xpression on the chemosensitivity of human hepatocellular carcinoma cell(HCC). Methods：RASSF1A expression vector and empty vector were transfected into HCC cell line QGY-7703 with Lipofectamine 2000 reagents. The positive clones that expressed RASSF1A gene stably were chosen by G418 and checked by R
5、T-PCR and Western Blot. Cell inhibited rate(IR) was measured after the treatment with the antitumor agents ADM, MMC, VP-16, 5-FU and DDP. Results：The HCC cell lines that reexpressed RASSF1A gene stably were established successfully. The suitable concentration of G418 used for selection agent was 800
6、 g/ml for QGY-7703 cell line. After being treated with MMC, the IR of cells reexpressing RASSF1A was maximal，and it was 21%, using QGY-7703 cell as control. Conclusion： The expression of RASSF1A could increase the cell IR induced by MMC. RASSF1A gene expression had no effect on the chemosensitivity
7、of human hepatocellular carcinoma cell treated with ADM, VP-16, 5-FU and DDP.Key words Hepatocellular carcinoma; Ras association domain family 1A; Drug-sensitivity; Rerverse transcriptase polymerase chain reactionRASSF1A(ras association domain family 1A)基因是近年来发现的一个重要的抑癌基因，其抑制肺癌、肾癌、膀胱癌细胞生长的功KKME-专业医学
8、搜索引擎 http:/ 基因的表达使肺癌细胞株 NCI-H1299 生长阻止在 G1/S 期与抑制细胞周期蛋白cyclin D1 的表达累积有关4，5。但对于 RASS-F1A 基因的表达对化疗药物敏感性的研究国内外尚未见报道，本研究通过建立稳定表达 RASSF1A 基因的肝癌细胞株，观察 RASSF1A 基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响。1 材料和方法1.1 质粒、细胞株及主要试剂 pcDNA3.1(+)RASSF1A 质粒由美国 Pfeifer 博士惠赠1。真核表达载体 pcDNA3.1(+)购自Invitrogen 公司，肝癌细胞株 QGY-7703 由国家人类基因组南方研究中心常
9、规保存，用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养。所有细胞均在 37.0 、5%CO2 及饱和湿度的培养箱内培养。脂质体Lipofectamine 2000、G418、Trizol RNA 抽提试剂、二抗羊抗鼠 IgG-HRP 均购自 Gibco 公司;一抗鼠抗人 RASSF1A 单克隆抗体购自eBioscience 公司;RNA 逆转录酶 SuperScript reverse transcriptase 购自 Clothe 公司; Cell Titer 96(R) AQueous Non-Radioative Cell Proliferation Assay 试剂盒购自 Progema
10、 公司。1.2 G418 对肝癌细胞株的毒性试验 各细胞株按 1105/孔接种于 6 孔板，细胞贴壁后，按 0、200、400、600、800、1000 g/ml 的 G418 浓度加入相应培养基，每周换液 2 次，2 周后弃培养基。1.3 稳定表达株的建立 严格参照 Lipofectamine 2000 说明KKME-专业医学搜索引擎 http:/ pcDNA3.1(+)RASSF1A(经测序鉴定)及 pcDNA3.1(+)各 2 g 转染对数生长期的 QGY-7703，转染后 20 h 换新鲜培养基，48 h 后以 110 稀释传代培养，72 h 后按相应浓度的G418 进行筛选。待转染细
11、胞呈小克隆生长时，用 Disco 纸片将G418 抗性细胞克隆依次转到 96 孔板、24 孔板、6 孔板或 35 mm 培养皿中扩大培养。收集细胞蛋白，RT-PCR 和 Western Blot 鉴定是否有目的基因的表达，并将阳性细胞克隆冻存备用。1.4 RT-PCR Trizol 法提取各组细胞的总 RNA，逆转录反应使用随机引物 OligdT18 合成第一链(严格按照厂家说明书进行)。RASSF1A 引物序列R1：5-GATGAAGCCTGTGTAAGAACCGTCCT-3，R2：5-CAGATTG-CAAGTTCACCTGCCACTA-3，扩增产物为 245 bp;内参照 -actin,
12、1:5-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3，2:5- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3，扩增产物为 300 bp。退火温度均为 58 ;PCR 产物于 2.0%琼脂糖凝胶电泳。1.5 Western Blot 取 40 g 细胞裂解液进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白电转至 PVDF 膜上，固定封闭后，依次与一抗、二抗结合，增强化学发光法(ECL)显色后暗室显影。1.6 药物敏感性实验(药物作用浓度根据已知的临床研究过的血浆浓度为基础) 将各克隆细胞接种到 96 孔板中，每孔 1104KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3 复孔，实验组第
13、 2 天以终浓度为 3.0 g/ml 加化疗药物丝裂霉素(mitomycin, MMC)，0.5 g/ml 加化疗药物阿霉素(adriamycin ADM)，1.6 g/ml 加化疗药物鬼臼乙叉甙(etoposide, VP-16), 3.0 g/ml 加化疗药物顺铂(cisplatin, DDP)，6.0 g/ml 加化疗药物 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracilur, 5-FU)，对照组不加化疗药物。24 h后进行细胞生长抑制率(cell inhibited rate，IR)的测定，采用 Progema公司的 Cell Titer 96(R) AQueous Non-Radioati
14、ve Cell Proliferation Assay 试剂盒检测，方法参考产品说明。计算公式：IR= 100%1.7 统计学方法 采用组间 t 检验，P55%)而得名。该蛋白质的具体生物学功能目前还未完全了解。MMC 是一种常用的周期非特异性的细胞毒性药物，作用机理主要和 DNA 双链交叉连接，抑制 DNA 复制，并使部分 DNA断裂。MMC 是近年来在肝癌化疗中常用的药物之一，但由于肿瘤耐药性的出现或肿瘤负荷的增加,可最终导致化疗效果不佳。因此，研究肝癌的化疗影响因素具有一定的临床价值。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ RASSF1A cDNA 导入了肝癌细胞 QGY-7703 中
15、，获得了能稳定表达外源性RASSF1A 蛋白的肝癌细胞克隆 Q。结果显示，Q 对 MMC 的敏感性增强，其主要作用机理可能为诱导敏感靶细胞的凋亡。化疗药物作用于肿瘤细胞中特定的靶点如 DNA、RNA、微管等并导致其损伤，继而通过死亡受体配体途径和(或)促使线粒体释放细胞色素C，激活细胞凋亡过程中的关键酶 caspases，再由活化的 caspases 作用于其底物，使肿瘤细胞发生凋亡并呈现出细胞凋亡的一系列特征性形态学改变，如染色质凝聚、凋亡小体形成并由周围巨噬细胞吞噬等。本研究发现，转染野生型 RASSF1A 基因后再联合应用MMC，肝癌细胞在原本不敏感的药物浓度作用下出现了明显的生长抑制效应。实验结果表明恢复 RASSF1A 基因的功能，可提高肝癌细胞对部分化疗药物的敏感性。可见，RASSF1A 基因联合化疗药物对肝癌的治疗是一种可行、有效的治疗手段。【参考文献】1 Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of a Ras association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3J. Nat Genet, 2000，25(3):315-319.2 Igor K, John
