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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用用作者：李德全,黄晓元,龙剑虹,杨兴华 作者单位：中南大学湘雅医院烧伤整形科，湖南 长沙 410008【摘要】目的： 探讨人真皮成纤维细胞热损伤变性后HSP90 的保护作用. 方法：培养的人真皮成纤维细胞在 52，30 s热水损伤 24 h 后用免疫荧光观察 HSP90 表达部位的改变并与正常组比较，用 Western Blot 进一步分析正常的 FB 和热变性的 FB 在 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 及 120 h 时相点 HSP90 表达量的改变.
2、结果：用免疫荧光观察到 FB 热损伤后 24 h 胞质胞核中出现 HSP90 高表达. Western Blot 显示 3 h 即有 HSP90 表达量升高，24 h 达到高峰，维持到 96 h，120 h 恢复到正常. 结果： FB 热变性可以引起 HSP90 异常高表达，HSP90 对 FB 热损伤具有保护作用.【关键词】 成纤维细胞;热损伤;热休克蛋白质 90;保护0 引言成纤维细胞(fibroblast, FB)是创面修复的主要细胞1，在实验中我们发现 FB 受到热损伤后经过一段时间可以完全“恢复“. 热休克蛋白 90(heat shock proteins, HSP90)是广泛存在于
3、真核和原核细胞中的分子侣伴，在蛋白的修复、信号传导中发挥重要作用2-3. 但HSP90 在 FB 热损伤后整个恢复过程中的变化却少见报道，本研究以烫伤成纤维细胞为实验模型，结合免疫荧光和免疫印迹深入分析KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 损伤后不同时间内 HSP90 水平表达变化，为临床治疗提供理论依据.1 材料和方法1.1 材料 5 g/L 胰旦白酶+0.2 g/L 乙二胺四乙(EDTA),DMEM，新生小牛血清，载玻片 20 mL/L 小牛血清封闭液，125山羊 HSP90 一抗(Santa cruz，美国)，FITC 标记免抗山羊 IgG(H+L) (二抗,武汉博士德)，5 mL/
4、L TritonX 100 打孔液，CeLLpticTM ceLL Lysis Reagent (Sigma)，蛋白 Marker，马抗人 actin 一抗 (Santa cruz，美国)，山羊抗马 actin 二抗(Santa cruz，美国).1.2 方法1.2.1 细胞培养取门诊手术切除的小儿包皮,用生理盐水清洗3 次，10 g/L 碘伏浸泡 5 min，再用生理盐水清洗 3 次，在含有青霉素(1000 万 U/L)的生理盐水中剪除皮下脂肪组织和筋膜，将分离后皮肤转移到 5 mL 锥形瓶中剪成糊状，加入 2.5 mL 5 g/L 胰蛋白酶+0.2 g/L 乙二胺四乙(EDTA),在 37
5、，1000 r/min 恒温器下振荡 1.5 h，加含 100 mL/L FCS 的 DMEM 2.5 mL 中和胰酶，用 100 目金筛网过滤，过滤液经 1000 g 离心 10 min，收集细胞，以 1108/L 接种于 75 mL 玻璃培养瓶中， 37，50 mL/L CO2 孵箱中培养. 24 h后倒置显微镜观察有部分细胞贴壁，更换细胞培养液，更换下来的培养液重新离心获取细胞培养，前 3 d 每日换液，以后视细胞生长情况 35 d 换液一次，34 wk 左右可见细胞贴满瓶底，取第515 代细胞做实验用.KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 人皮肤成纤维细胞热损伤反应当细胞生长融合达
6、 80%时，用 5 g/L 胰蛋白酶+0.2 g/L 乙二胺四乙(EDTA)消化，配成2108/L 细胞悬液，分为正常组和实验组，每培养瓶中的细胞悬液为 4 mL. 正常组培养瓶浸入 37液平面下 30 s，实验组则在 52浴水中浸泡 30 s 形成热损伤变性，分别于3，12，24，48，72，96，120 h 为时相点收集细胞进行检测，实验重复 3 次.1.2.3HSP90 免疫组织化学荧光检测将正常组和实验组 FB分别倒入置有载玻片的六孔培养板中，置于 37, 50 mL/L CO2 孵箱中培养 1 d，按常规方法进行免疫细胞化学染色，HSP90 一抗，FITC 标记免疫为二抗，阴性对照用
7、 0.01 mmoL/S PBS 代替一抗，其余步骤不变.1.2.4HSP 90 Western Blot 分析首先提取 FB 中总蛋白，按BCATM Protein Assay kit(Pierce) 说明测定蛋白质浓度，分装后将其置于-70待用. 每个样品取 30 g 蛋白质加入等体积 3SDS 凝胶加样缓冲液中，100煮沸 5 min，经 100 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，100 V 电转移 PVDF 膜 1.5 h，20 g/L BSA 室温封闭 4 h,加入12000 稀释 HSP90 一抗(Santa cruz, 美国)，4过夜，PBST 洗膜，加 13000 稀释生物素标记二
8、抗(武汉博士德公司)，37孵育 1 h，PBST 洗膜，滴加超敏曝光液(Pierce, 美国)曝光，在 GelDoc 2000 凝胶成像系统进行显影及行灰度值比较.统计学处理： 所有数据采用 SPSS 10.0 进行处理,实验数据KKME-专业医学搜索引擎 http:/ xs 表示，各组间比较用单因素方差分析.2 结果2.1FB 热损伤后 HSP90 免疫荧光检测正常情况下 FB 中HSP90 阳性染色弱，主要分布于胞质中，热损伤 24 h 胞质内阳性着色显著增强，而且在一些胞核内还出现强阳性着色(图 1，2).2.2FB 热损伤后 HSP90 Western Blot 结果 FB 热损伤后
9、3 h HSP90 的表达即开始升高(x=0.365, n=4, P0.05,图 3). 图 1 正常 FBHSP90 免疫荧光结果可见阳性荧光较弱,主要分布在细胞质中100图 2FB 烫伤后 24 h HSP90 免疫荧光结果,可见胞质中阳性荧光显著增强,且胞核内也出现较强的阳性荧光100图 3 严重烫伤 FB HSP90 Western Blot 结果3 讨论成纤维细胞是创伤修复的主要细胞1. 深烧伤创面处理的研究一直是烧伤界的热点4，但深创面间生态和残存真皮中的损伤的 FB 变化转归却一直被忽视. 目前国内外还没有一个较好的深创面 FB 热变性的细胞模型5. Caitlin 等6提出了
10、51.5，30 s 为 NIH3T3 热变性损伤模型. 我们通过反复预实验，发现 52，30 s 造成的 FB 热损伤符合细胞变性的形态学特点：胞膜完整，少量微绒毛,胞质中有大量空泡变性,线粒体肿胀,髓鞘样改变,内质网扩张KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 经过一段时间后其形态、结构和功能均能恢复. 以往人们对 HSP70 在损伤中的作用研究较多，但对HSP90 在 FB 热变性的转归中的变化却少见报道.热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一簇在结构上高度保守的多肽，广泛存在于生物细胞中，参与细胞内损伤蛋白的修复，跨膜转运、信号传导，抑制凋亡及促进增殖等2-3,
11、7-8. 在应激反应时，无活性的单体热休克因子(heat shock factors, HSF) 聚集成为有活性的三聚体，启动热休克元件(heat shock elements, HSE)基因表达，产生热休克蛋白，发挥“分子伴侣“作用. HSP90 是其家族中的重要成员. 根据冬氨酰胺片段大小不同分为 , 两类，两者同源性达84%，以 , 形式存在，其量大致相等，均为胞质蛋白，相比之下， 易受热诱导， 易受有丝分裂影响9. 在 ATP 协助下，HSP90 主要帮助受损蛋白转运、折叠，防止聚集并恢复其正常构象， 与类固醇激素利用有关，当细胞受到激素作用时，原来与类固醇受体功能活性部分结合而维持其
12、无活性稳态的 HSP90 与之解离，相应的激素配体与受体结合，进入细胞核启动基因表达而发挥作用10. 此外，HSP90 还可抑制细胞凋亡、促进增殖和影响细胞周期等作用. 细胞内过多或过少的 HSP90 均不利于细胞的生存11. 因此有必要检测细胞模型中 HSP90 蛋白合成的情况变化并结合细胞应激损伤情况确定 HSP90 在本实验条件下的作用. 本组免疫细胞荧光反应显示正常 FB 不表达或弱表达 HSP90，而热变性的 FB 24 h HSP90 表达明显增强，部分细胞核内亦有异位表达. Western Blot 显示 FB 热KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3 h 即有 HSP90
13、 表达，24 h 达到高峰，维持到 96 h，120 h HSP90 基本恢复到正常水平. 我们通过透射电镜观察到在 FB 热损伤后的第 1 日变性形态学改变最明显，同时 Western Blot 显示 HSP90在该时相点表达最高，这些说明 HSP90 升高可能对 FB 热损伤有保护作用，同时，HSP90 可以维持到足够的时间，直到热损伤的 FB基本恢复.王军平等12在研究严重烫伤大鼠肝脏中发现 HSP90 可以维持到 72 h，而我们的实验却发现 HSP90 可以维持到 96 h，一直到120 h 才基本消失，这可能也与上述因素有关.综上所述，HSP90 在 FB 热变性恢复过程中发挥重要
14、作用，但 FB 是通过何种具体的热休克因子表达 HSP90?此外，为什么会在核内异位表达，其基因如何表达，表达量在何范围内是有利的，是否确实与类固醇激素或细胞因子有关等13?这一切均有待于进一步研究.【参考文献】1 王益民，韦福康，刘敏. 成纤维细胞与创伤修复的研究进展J. 中国修复重建外科杂志，2000,14(2):126-128.2 Larry A, Sonna, Jun F, et al. Molecular Biology of thermoregulation Invited Review: Effects of heat and cold stress on mammalian g
15、ene expressionJ. Appl Physio, 2002,92(12):1725-1742.3 BoGeon Y, Robert L, Matts T. Differential effects of Hsp90 inhibition on protein kinases regulating signal transduction pathways required for myoblast differentiationJ. Exp Cell Res, KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 彭毅志. 提高深烧伤创面的处理水平J. 中华烧伤杂志,2005,21(1):12-13.5 程飚,付小兵,盛志勇. 离体成纤维细胞热损伤模型制作的研究J. 中华烧伤杂志,2002,18(17):391-393.6 Caitline EO, ConnellRodwell, David Shriver, et al. A genetic reporter of thermal stress defines physiologic zones over a defined temperature rangeJ. The FASE
