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1、实验二实验二 质粒质粒 DNA 的提取及酶切的提取及酶切 （8 学时，6 小时） 一、实验目的：一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。二、实验原理二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色 体 DNA 之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。环状闭合的质粒 DNA 在限制 性内切酶的作用下成为线状质粒 DNA，内切酶能识别 DNA 分子中某一特定的 核苷酸序列。 三、仪器、材料、试剂三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床 2、台式离心机 3、高压灭菌锅 4、振荡器 (二)材料：1、 含 PUC-18 质粒的大肠杆菌 2、乙二胺四乙
2、酸(EDTA) 3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸 钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris 饱 和酚 11、氯仿 12、异戊醇 13、乙醇 14、胰 RNA 酶 15、 氨苄青霉素 16、离心管 (三)试剂：1、溶液 (pH8.0) 2、溶液 3、溶液 4、TE 缓冲液 (pH8.0) 5、0.5mol/LEDTA 6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1) 7、Tris 饱和酚:氯仿: 异戊醇(V:V:V=25:24:1) 8、70%乙醇 9、胰 RNA 酶 10、ECOR I 酶 四、实验
3、步骤四、实验步骤 （一）质粒（一）质粒 DNA 的提取的提取 1、先在 3mL LB 液体培养基中加入 3uL 羧苄青霉素(终浓度 50ug/mL)，然后接 入一个含 puc-18 质粒的大肠杆菌单菌落，37震荡培养过夜。2、取过夜培养的菌液 1mL 加入 1.5mL 离心管中，4000r/min，倒出培养液，将 所有菌体细胞收集在一个离心管中。 3、加入 100l溶液 于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室 温放置 10min。 4、加入 200l溶液(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶 液 (千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过 5min)。 5、加入 150l
4、溶液 (冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置 15min 让质粒 DNA 复性(千万不可用旋涡震荡器)。 6、12000r/min 离心 10min，将上清转至另一 1.5mL 离心管中。 7、向上清中加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇溶液，旋涡混匀，12000r/min 离 心 5min，将上清转至另一 1.5mL 小指管中。 （注意用枪取，记着取多少） 8、向上清中加入等体积氯仿：异戊醇，旋涡混匀，12000r/min 离心 5min，将 上清转移到另一个 1.5mL 离心管中。 9、向上清中加入 2 倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30min。12000r/min 离心 10mi
5、n，吸去上清液。 10、用 200l 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀 1 次(12000r/min 离心 5min)，吸去上 清液，空气中干燥。 11、加入 20uLRTE，使质粒 DNA 完全溶解。 （二）质粒（二）质粒 DNA 的酶切的酶切 1、酶切：取 10l制备好的质粒 DNA 溶液，加 2l酶切缓冲液，再加 2lECOR I 酶，再加无菌水 6l，370C 保温 2h。 2、把提取的质粒和酶切的质粒-200C 保存。 五、实验结果五、实验结果 有白色质粒沉淀，然后又溶解。 六、分析讨论六、分析讨论 1、溶液溶液 、溶液、溶液、溶液、溶液 的作用分别是什么的作用分别是什么? 2、为什么真核生物基因组为什么真核生物基因组 DNA 不能用碱裂解法提取不能用碱裂解法提取? 3、本实验需要掌握哪些知识和技术？本实验需要掌握哪些知识和技术？
