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1、遗传学研究方法与技术实验指导遗传学研究方法与技术实验指导王晓雯1前言遗传学之所以被一些学生看作是生物学中最难的课程之一，主要是因为在遗传学学习过程中不得不加以思考和想象。产生遗传规律的染色体结构与遗传物质传递过程却几乎是不可见的，这是 P.C. Winter等对遗传学的描述，它生动地反映了遗传学的一个重要特点抽象性。遗传学既抽象，又具有相当强的理论性，而且与实践紧密结合，应用广泛，是生物、医学、农林类等专业的重要专业基础课程，也是动物、植物育种的理论基础。遗传学的基本概念、基本原理来自于人类生产、生活和科学研究的实践，实验教学可使学生更易理解和接受遗传学抽象的概念和原理，因此实验是遗传学教学中
2、不可缺少的重要环节。通过实验可以掌握从群体、个体、细胞以及分子水平来研究生物质量性状和数量性状的遗传变异现象及其规律的实验技术和试验结果的分析方法。所以说，遗传学的教学过程不仅是一个知识传授的过程，而且是一个探索生物遗传奥秘的过程，一个分析问题、解决问题的过程。遗传学应用的一个重要方面是指导动植物、微生物的遗传改良，通过实验也可以了解遗传学理论与技术在生物遗传改良等方面应用的基本原理和方法。普通遗传学实验是与普通遗传学相配套的课程，是我校加强实践环节教学改革的尝试之一。普通遗传学课程以经典遗传学为基础，同时介绍细胞遗传学、分子遗传学、数量遗传学、群体遗传学等遗传学分支学科的基本理论，为继续深入
3、学习这些分支学科奠定基础。普通遗传学实验教学的内容也应包括遗传学研究的基本原理、技术与方法，培养和提高学生实验操作技能与分析问题、解决问题的能力。为此，在结合我校多年开设遗传学实验课的特点和吸取兄弟院校遗传学实验教学的宝贵经验的基础上，我们组织多年从事遗传学理论与实验一线教学科研工作的教师整理编写而成适合我校教学实际的遗传学实验教材。本实验教材包括五个部分共 30 个实验，其内容安排主要以杨业华、朱军分别主编的面向 21 世纪教材普通遗传学（高等教育出版社，2000）和遗传学（农业出版社，2000）的内容为依据，并适当编入了一些有关细胞遗传学、数量遗传学、群体遗传学和分子遗传学方面的实验。为了
4、使学生了解遗传学实验室的操作规范和必要守则，认真作好实验前后的各项工作，教程首先编入了实验室工作规程。同时，为了便于准备实验材料、用具和配制药品，在本教程的最后列出了八个附录，以供参阅。2实验室工作规程实验室工作规程为保证遗传学实验能正常进行并获得理想的实验结果，避免在实验中发生差错和意外事故，实验操作者必须严格遵守实验室规则，认真做好实验前后和实验过程中的各项工作。一、基本规则一、基本规则1实验前必须预习，明确本次实验的目的、原理、内容和方法。实验时须保持安静，按实验教材和指导教师的要求进行操作，并详实记录实验中出现的情况和获得的实验结果，对资料进行整理分析，得出结论，写出实验报告。2实验室
5、、工作台、各种仪器、用具、玻璃器皿等必须保持清洁整齐，工作台要严防酸、碱腐蚀。各种化学药品、试剂等必须贴上标签，分门别类，放置一定位置，便于取用。3正确使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台和所用仪器。如有沾污，须立即用镜头纸擦拭干净。4取用药品时，所用各类量具必须分开，严禁混用，用后须立即冲洗干净。称量固体药品时，必须在秤盘上铺垫清洁白纸或蜡光纸，调试平衡后再称，以防药品腐蚀秤具。称量纸要做到一称一换，以防药品混杂，导致所配试剂不纯。5遵守化学实验的操作要求，注意药品配制和使用时的安全。6实验完毕，须做好清洁整理工作，所用仪器、物品应放还原处。实验过程中如有损坏或丢失仪器用具，
6、应如实填写报告单，视情况进行相应处理。7全班实验结束后，值日生安排整个实验室的全面清理打扫。离开实验室前，必须关闭所用仪器和灯具的电源，关紧水龙头和门窗。二、显微镜的清洁和保养二、显微镜的清洁和保养显微镜是遗传学实验的重要仪器，使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀，在清洁保养中要做到以下几点：1取镜时必须一手提镜臂，一手托镜底，防止显微镜滑落损坏。32取出显微镜后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物，用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物，再用镜头纸擦拭物镜和目镜，最后用细白丝绸把镜头再擦一次。3镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜，在高倍镜下只能用微调螺旋调焦，细心操作，以防压碎玻片，损坏镜
7、头。4若发现镜头被药物或脏物污染，立即用擦镜纸醮少许二甲苯（以刚湿润纸为度）擦掉污物，再用擦镜纸擦干。5用完显微镜后进行清洁整理，将载物台放至最低处，转动物镜使之不要对着聚光镜，将显微镜放回原处。6严禁将显微镜与化学药品混藏。三、玻璃器皿的清洁三、玻璃器皿的清洁实验室所用玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，实验前必须对玻璃器皿彻底清洗。（一）初用玻璃器皿的清洗1新购置的玻璃器皿表面常附有游离的碱性物质，可先用肥皂水或去污粉洗刷，再用清水冲洗干净，然后用 12的盐酸浸泡 4h 以上，再用清水冲洗后用蒸馏水冲洗 23 次，100130烘干备用。2新载玻片和盖玻片分别在盐酸乙醇7095工业乙醇（C2
8、H5OH）100ml 加浓盐酸（HCl）2ml中浸泡 4h，流水冲净，蒸馏水荡涤、晾干，置 95乙醇中加盖，以便随时取用。（二）使用过的玻璃器皿的清洗1使用过的器皿应在未干前洗涤，如不能及时清洗，应浸在凉水中。洗涤方法：放入洗衣粉水中煮沸半小时，刷洗，清水冲净，蒸馏水荡涤，晾干或烘干；或在洗涤液中浸泡半小时，清水冲洗，蒸馏水荡涤，晾干或烘干。2对移液管、滴定管、量筒、量器等，使用后应立即浸泡于凉水中，避免残留的溶液干涸，难以清洗。工作完毕后用流水冲洗，除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后浸泡在铬酸洗液中 46h 或过夜，再用清水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗 24 次，风干后备用。注：铬酸洗液配制
9、方法 重铬酸钾（K2Cr2O7） 20g，浓硫酸（H2SO4，工业用，比重 1.84）或废硫酸100ml，清水 100ml。先将重铬酸钾溶于温水，冷却后徐徐加入浓硫酸，避免发热。此液呈红色，加盖防氧化变质，反复使用至变蓝黑色为止。器皿玻片洗净后再用此液浸泡，可延长其使用时间。43陈旧或用过的永久制片的玻片，可先在肥皂水中煮沸 510min，或将玻片微热后浸入二甲苯中脱胶，洗去残留的树胶和浆糊，并用清水冲洗干净。然后放入洗液中浸泡 30min，再用清水冲洗掉残留的洗液，最后用蒸馏水洗净，置 95乙醇中保存备用。四、玻璃器皿的干燥和灭菌四、玻璃器皿的干燥和灭菌遗传学实验中以微生物为实验材料时，实验
10、所用的玻璃器皿必须干燥和高温灭菌，防止杂菌污染。（一）干燥干燥的方法有自然晾干和烘干两种。自然晾干所需时间长，但器皿上无水渍。烘干是将器皿及其它用具置 6080烘箱中干燥，但器皿上可能留有水渍，因此，在干燥之前应尽可能除去器皿上的水滴。（二）灭菌因高温能使微生物蛋白质变性，所以高温处理能达到灭菌的目的。高温灭菌的方法有干热灭菌法和湿热高压灭菌法两种。1干热灭菌法将器皿及用具置 160 2h，即可利用热空气杀死所有微生物及芽孢。在干热灭菌过程中要注意：（1）烘箱内忌放易燃、易挥发物品，物品不能装得太满，棉塞等物品不能接触烘箱壁，以免发生燃烧事故。（2）烘箱温度达 100以上后，切忌打开烘箱玻璃门
11、，否则新鲜空气进入会引起燃烧，或因剧烈的冷热变化而使玻璃器皿爆裂。2湿热高压灭菌法此法高温与高压结合，蒸汽传热均匀，灭菌时间短，效果好。常用各种高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。一般当蒸汽压力达 1520 lb/in 2 、温度达 121125时，保持 2040min 即可达到满意的效果。用此法灭菌应注意：（1）灭菌锅内水量要适当，过少会烧干而发生事故，过多会导致消毒物品水湿。（2）灭菌开始时打开放气阀，加热使蒸汽将锅内的冷气排出，然后再关上放气阀继续加热。否则灭菌效果不好。（3）灭菌加热时要随时注意压力变化，如压力指针超过红色警戒线而安全阀仍未放气，则可能是安全阀失灵，应立即停止加热，以防爆炸。（4）
12、溶液或培养基灭菌后不能立即放气， 以免器皿炸裂或溶液喷出，需待其5自然冷却，压力降至零时才可打开放气阀，揭开锅盖。染色体观察基础知识染色体观察基础知识生物之所以能表现出复杂的生命活动，主要是由于生物体内遗传物质表达，推动生物体内新陈代谢过程的结果。生命之所以能世代延续，也是因为遗传物质延绵不断传递给后代的缘故。真核生物的遗传物质在细胞中主要以染色质的形式存在于细胞核内，在细胞分裂期形成染色体。染色体是基因的载体，其形态特征和数目因物种不同而各有差异，同一物种的染色体数目及形态特征是相对稳定的，真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。染色体的形态特征在细胞分裂过程中呈周期性变化，要对染色
13、体的形态、结构和数目进行研究，必须熟悉细胞分裂过程以及染色体的行为变化，掌握染色体标本的制作技术。最常见的高等生物细胞分裂包括有丝分裂和减数分裂。一、细胞周期与有丝分裂一、细胞周期与有丝分裂有丝分裂是多细胞生物体细胞增殖的主要方式，细胞经过有丝分裂，一个细胞分裂为两个子细胞；核内染色体准确地复制、均等地分配到两个子细胞中，子细胞染色体组成与母细胞完全一样。从细胞上一次分裂完成到下一次分裂结束的这段历程称为一个细胞周期（Cell Cycle），一个细胞周期包含一个分裂间期和一个分裂期。（一）分裂间期(interphase)一次细胞分裂结束到下一次细胞分裂开始之间的一段时期。此时在光学显微镜下看不
14、到染色体，只能看到均匀一致的细胞核及染色较深的染色质。实质上间期核处于高度活跃的生理生化代谢阶段，为细胞继续分裂准备条件。（二）分裂期(mitosis)有丝分裂期是一个连续过程，为了便于研究和描述，通常将有丝分裂期划分为前期、中期、后期和末期。有丝分裂期在整个细胞周期中约占 10，而其余大部分时间是处于细胞两次连续分裂之间的间期。细胞有丝分裂各时期染色体的行为变化与形态特征简述如下：61前期(prophase)核内染色质开始逐渐螺旋化，浓缩为细长而卷曲的染色体，并逐渐缩短变粗。每条染色体含两个染色单体，拥有一个共同的着丝点。核仁和核膜逐渐模糊不明显。动物细胞的中心体一分为二，并向细胞两极移动，
15、周围出现星射线，形成纺锤丝；高等植物直接从细胞两极放出纺锤丝。这个时期又可细分为三个时期：（1）早前期 染色体细而长，染色质螺旋卷曲形成大小不同、着色较深的染色粒，一般制片染色线不可见，镜检时仅见核内充满大小不一、深浅不同的染色粒。核仁染色较深，仔细观察便可见到。（2）中前期 染色体继续收缩，染色线周围基质不断增加，染色加深，染色体呈连续的线状。此时染色体仍扭曲很长，并互相缠绕，犹似一团搅乱的粗麻线。这时仍可见核膜、核仁，但在普通生物显微镜下核膜一般不易见到，核仁隐约可见。（3）晚前期 染色体进一步螺旋化缩短变粗，明显可见每一染色体含有两个染色单体，染色体趋向中央赤道板，但仍然相互缠绕，核膜、
16、核仁逐渐消失。2中期(metaphase)染色体高度螺旋化，核仁、核膜均已消失，纺缍丝与染色体的着丝点相连形成纺缍体（因纺锤丝不着色，在光学显微镜下不可见，但有时会因纺锤丝影响细胞质着色微粒的排列，可隐约见到纺锤丝分布位置）。由同一着丝点相连的两个姊妹染色单体非常清晰，具有典型、稳定的形态特征。着丝点位置清晰（在染色体某个地方出现的不着色透明点即着丝点，它将染色体分成两段），且排列在赤道面上，染色体臂自由伸展，分布于赤道面两侧。中期侧面观染色体排列图象形似轮辐条状；极面观犹似某种菊花状。此期是采用适当制片技术进行染色体形态和数目鉴别的最佳时期之一。3后期(anaphase)染色体着丝点纵裂为二，姊妹染色单体在纺锤丝牵引下互相分开，各成为一条独立染色体移向细胞两极；每极有一组染色体，其数目和母细胞染色体数目相同。4末期(telophase)分开后的两组染色体到达细胞的两极，纺锤体解体，染色体解螺旋化，逐渐变得松散细长，核仁、核膜重新出现。植物细胞赤道板处形成膜体，并形成细胞
