植物细胞工程实验

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1、0植物植物细细胞工程胞工程实 验 报 告班级：班级： 姓名：姓名：学号：学号： 指导老师：指导老师： 时间：时间： 1目目录录实验准备：实验准备：培养基母液的配制培养基母液的配制培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌实验一、香蕉吸芽的组织培养实验一、香蕉吸芽的组织培养实验二、烟草叶片的组织培养实验二、烟草叶片的组织培养实验三、木薯的微繁技术实验三、木薯的微繁技术实验四、桉树再生体系建立实验四、桉树再生体系建立实验五、玉米花生成熟胚培养实验五、玉米花生成熟胚培养 实验六、柱花草叶片组织培养实验六、柱花草叶片组织培养实验七、实验七、水稻盾片组织培养水稻盾片组织培养自选实验：洋葱、仙人掌的组织培养自选

2、实验：洋葱、仙人掌的组织培养2实验准备：实验准备：培养基母液的配制培养基母液的配制一、实验目的一、实验目的 掌握培养基母液的配制。在配置培养基之前，为了方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、 铁盐、有机物、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配置培养基时，只需按预 先计算好的量吸取母液。 二、实验原理二、实验原理 培养基是植物细胞、组织和器官吸取营养的场所。在植物细胞的分裂和分化过程中，需要各种营 养物质，这些营养物质包括无机营养成分、有机营养成分、植物生长调节物质等。在对植物的器官、 组织和细胞进行离体培养时，只是切取植物体的一小部分，它们无法象整体植株那样合成生长发育所

3、 需的全部物质。而自然界的植物千差万别，每一种植物都有自己独特的生理代谢过程和各自的营养需 求，没有哪一种培养基能够适用于所有植物。因此，对培养基组成成分的筛选是非常重要和必不可少 的程序。 目前对植物进行组培时，人们所使用的培养基只几十种，其中 MS 培养基应用最为广泛。说明 MS 培养基的无机盐成分对许多植物种均是适宜的，它的无机盐含量较高，微量元素种类较全，浓度也较 高。 三、实验试剂与仪器设备三、实验试剂与仪器设备 1、药品试剂： 母液、蔗糖、卡拉胶（或琼脂） 、NaOH 溶液、HCl 溶液、无菌水、NAA、BA、IAA、2，4-D 等。 2、仪器设备： 电子天平、量筒、PH 试纸、培

4、养瓶、解剖刀、酒精灯、高压灭菌锅、移液管、洗耳球、玻璃棒、 药勺、超净操作台、铁架、镊子等。 四、实验内容四、实验内容 （一）母液的配制 MS 培养基母液方案配制如下表：成 分1L 母液的用量(mg/L)每升培养基取用量(ml)备 注大量元素(20X)NH4NO333000KNO338000KH2PO43400MgSO47H2O740050CaCl2660050单独配制铁盐(100X)FeSO4.7H2O2780Na2-EDTA373010微量元素（200X）KI166H3BO31240MnSO4.H2O3380ZnSO4.7H2O172053Na2MoO4.2H2 O50CuSO4.5H2O

5、5CoCL2.6H2O5 有机元素(100X)VB110VB650 烟酸50 甘氨酸200 肌酸1000010具体配制步骤如下： 1、大量元素母液的配制 无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大 20 倍，用感量为 0.01g 的扭 力天平，分别用 50mL 烧杯称量，用重蒸馏水溶解.溶解时在每只烧杯中加入 30-40mL 重蒸馏水，置于 酒精灯上,加热使其溶解(注意温度不可过高，60-70)。溶解后，在 1000mL 量筒中，混合后用重蒸馏 水定容到 1000mL。其中 CaCl2单独配制。在加入母液时 CaCl2应最后加入，以免形成沉淀。将配好的混 合液倒入细口瓶中，贴

6、好标签保存于冰箱中。配制培养基时，配 1000mL 培养基取此母液 50mL。 2、微量元素母液的配制 无机盐中微量元素母液，按照培养基配方用量的 200 倍，用微量 0.0001g 的电光分析天平，分别 用 50mL 烧杯称量，用重蒸馏水溶解。混合定容于 100ml 容量瓶中保存于冰箱中,配制培养基时，每配 制 1000mL 培养基取此母液 5mL. 3、铁盐母液的配制 无机盐中铁盐母液，按照培养基配方用量的 100 倍，用感量 0.01g 的扭力分析天平，分别用 50mL 烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制 1000mL 培养基取此母液 10mL。 4、有机元素的配制

7、 无机盐中有机元素母液，按照培养基配方用量的 100 倍，用感量 0.01g 的扭力天平，分别用 50mL 烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制 1000mL 培养基取此母液 10mL。 五、注意事项五、注意事项 1、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如 Ca2+和 S042-，Ca2+、Mg2+和 PO43-一起溶解后，会产 生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。 2、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 3、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。 4、药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。 5、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其

8、中维生素 氨基酸类可以分别配制， 也可以混在一起。 5、母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。实验准备：实验准备：培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌一、培养基的配制及消毒一、培养基的配制及消毒： （1）按照 MS 培养基的配方（以配制 1LMS 培养基为例）取大烧杯加入先前配制好的母液其中包括：4大量元素 50ml、微量元素 5ml、铁盐 10ml、有机元素 10ml，最后加钙盐 50ml 充分混匀。再加入 30g 食用白糖，加入适量的去离子水使总量将近 1L，混匀后调 PH 值（调至 5.8-6.2） ，用 1000ml 量筒定容， 最后向培养基中添加 8.0g 卡拉胶混匀。注意

9、事项： 配制 MS 时，钙盐一定要最后加入； 1调好 PH 值后再加卡拉胶（或琼脂） 。 2（2）培养基配制好后分装到培养瓶中每瓶约 30ml，盖好瓶盖帖上标签。需要加入激素的培养基在 定容到 1000ml 后加入所需的激素。混匀后调 PH 值（调至 5.8-6.2） ，用 1000ml 容量瓶定容，最后向培 养基中添加 8g 卡拉胶，混匀后进行分装，然后装入高温高压灭菌锅进行灭菌（一般培养基用 0.1MPa，121.5，1530 分钟可达到彻底灭菌的目的） 。灭菌好后取出冷却备用。 （3）培养环境条件：培养温度为 28（-1、+1），光照强度 20003000LX，光照时间为 12h/d，

10、每隔 7 天观察一次。二、超净操作台的消毒二、超净操作台的消毒 消毒时先用 75%的酒精对超净台的各处进行消毒，点燃酒精灯放于超净台右侧，再对实验工具进行 灼烧灭菌，后放于架上冷却待用。并依次将实验中所用培养基瓶及所需试剂瓶进行消毒，置于超净台 左侧，注意实验中要用 75%的酒精对手进行消毒。实验一、香蕉吸芽的组织培养实验一、香蕉吸芽的组织培养前言前言：香蕉传统的繁殖方法多是采用吸芽分株法，这种方法的繁殖系数低，速度慢，难以满足当前大 规模的栽培生产，且容易传播疾病。利用组织培养的技术来对香蕉优质品种进行无性繁殖，这样不但 可以保持香蕉的优良性状，加快繁殖速度，而且，试管苗不带病虫害和病毒病，

11、并且，利用组织培养 技术得到的幼苗生长比较一致，有利于田间的管理和采收，本实验利用香蕉的吸芽作为外植体。1 1、材料和方法、材料和方法: 1.1 材料 (1)香蕉吸芽 (2)无菌纸、镊子、酒精灯等 (3)实验采用 MS 基本培养基，PH： 5.8-6 (4)诱导培养基： MSBA3mgL30gL 白糖+8.5gL 卡拉胶 (5)继代培养基： MSBA5mgL30gL 白糖+8.5gL 卡拉胶 1.2 方法 1.2.1 外植体消毒用自来水冲洗吸芽表面的泥土，剥离外假茎，只留下茎和假茎各 2-3cm 长，假茎的的直径有 2- 3cm，用洗衣粉清洗一遍，用自来水冲洗，转入 0.1%升汞浸泡 15-2

12、0min，其间不断搅拌，弃去升汞用 无菌水洗 3 遍（无菌水漂洗：将从升汞中取出的香蕉吸芽组织块转入无菌水中漂洗，不断摇动使漂洗 干净）留在瓶中备用。51.2.2 诱导培养 将香蕉吸芽放到无菌工作台的无菌纸上，用消毒刀将外植体的假茎的最外层剥掉，以及有消毒刀 将已经变色的茎外面一小层也切掉，然后从外植体茎中间一分为四，接入诱导培养基，共 4 瓶。7 天后 观察。 1.2.3 继代培养 将诱导培养得到的香蕉苗中长势较好的一瓶用作继代培养的材料，在超净工作台上将香蕉芽丛分 开，切去顶部叶片部分，削去底部褐化部分，将芽丛接种于香蕉继代增殖培养基中，接种 2 瓶。 1.2.4 培养条件： 培养温度为

13、28（-1、+1），光照强度 20003000LX，光照时间为 12h/d（注意香蕉吸芽诱导期 无需光照）,每个星期观察一次 。2 2、实验结果与分析：、实验结果与分析： 2.1 诱导培养：共接种了 4 瓶，出现一定的褐化现象，诱导率为 100%，污染率为 25%，说明用 0.1%的 升汞对香蕉的吸芽消毒 15-20min 的时间控制比较合理，消毒的效果也较好。附录 1、诱导培养实验结果统计表外植体数目成活数污染数成活率污染率441100%25%2.2 继代培养：从三瓶未污染的香蕉苗中选取长势最好的一瓶，继代培养两瓶，一瓶长势良好，另一 瓶香蕉苗由于褐化现象比较严重而死去。 原因：可能是因为在

14、继代的培养过程中，用刀切去褐化部分时切去的过多，使香蕉基部受伤严重而死 亡。3 3、注意事项、注意事项 1）整个实验过程要严格进行无菌操作； 2）倒培养基时要边用玻璃棒搅拌，边倒培养基，防止培养基的浓度不均匀； 3）观察记录时，要注意拿组培瓶的方式，手要握住组培瓶的下方而不要握住组培瓶的盖子； 4）发现污染的外植体，要及时清理干净，以免污染其他的； 5）观察记录时要仔细，认真描述并做好记录。实验二、烟草叶片组织培养实验二、烟草叶片组织培养前言前言：目前烟草一般采用有性繁殖，但繁殖的烟苗不均衡，易发生变异，而且易感病菌，造成多种病 害发生，品质退化，从而影响经济收人。用嫩叶片的组培方法，可以保持

15、优良品种的优良性状，减少 病虫害，从而达到高产优质的目的。另外，烟草生长速度快，生长周期短，所以是基因工程中最为广 泛使用的模式植物之一。本实验利用烟草的叶片作为外植体，诱导培养基为 MSBA 1.0 mgL。1 1、材料和方法、材料和方法: :61.1 材料 (3)1）烟草叶片、无菌纸、镊子、酒精灯等2）MS 为基本培养基3）诱导培养基： MSBA 1.0 mgL30gL 白糖+8.5gL 卡拉胶4）继代培养基： MSBA 1.0 mgLNAA 0.5 mgL30gL 白糖+8.5gL 卡拉胶 1.2 方法 1.2.1 外植体消毒 将烟草叶片洗净，将烟草叶片左右垫与牛皮纸上用手术刀切取 2c

16、m 长，2cm 宽的无主叶脉、主侧叶 脉的长方形叶片块（10 片左右） ，置于加了 1-2 滴土温的 0.1%的升汞溶液中消毒 10-15min，期间注意 不断摇动，取出叶片置于无菌水中清洗 3 次，留于最后清洗的无菌水中备用。 1.2.2 诱导培养 将烟草叶片取出将叶片周遍切去，再将每片叶切成 2 片，接入诱导培养基中，每 7 天观察记录一 次。 1.2.3 培养条件： 培养温度为 28（-1、+1），光照强度 20003000LX，光照时间为 12h/d，,每个星期观察一次 。2 2、实验结果与分析：、实验结果与分析： 1）诱导培养全部被污染，污染率 100%，诱导率为 0。原因可能是：灭菌不彻底，整组均被污染用升汞消毒的时间过短，因此应适当延长消毒时间。操作过程染菌 附录 1、第一次烟草诱导培养结果统计表接种瓶数诱导数污染数诱导率污染率4040100%2）未能进行继代培