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1、- 1 -单位代码 10635 学 号 S2005073硕硕士士学学位位论论文文豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因pslpsl 转化烟草研究转化烟草研究论文作者：周小全指导教师：张兴国 研究员学科专业：细胞生物学研究方向：细胞工程提交论文日期：2008 年 05 月 25 日论文答辩日期：2008 年 05 月 31 日学位授予单位：西南大学中 国 重 庆2008 年 5 月- 2 - 3 -2008 Master Thesis of Southwest UniversityIsolation of Early nodulin Genes from Pisum
2、 sativum and Introduction of Lectin Gene psl into Nicotiana tobacum Candidate： Xiaoquan ZhouSupervisor： Xingguo ZhangMajor： Cell biologyField： Cell engrneeringCollege of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University，Beibei，Chongqing，400715，P.R.ChinaMay 2008- 4 - 5 -独创性声明学位论文题目：豌豆早期结瘤
3、素基因克隆与凝集素基因 psl 转化烟草研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者： 签字日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位
4、论文在解密后适用本授权书，本论文：不保密，保密期限至 年 月止） 。学位论文作者签名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日- 6 -摘 要- I -豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因pslpsl 转化烟草研究转化烟草研究细胞生物学专业硕士研究生 周小全 指导教师 张兴国 研究员摘 要结瘤固氮是豆科植物与根瘤菌专一性作用的结果。在根瘤菌的第一步入侵至根瘤形成的每一个过程中，都伴随着宿主植物及根瘤菌特异性基因的表达。前人的研究已经证明，植物凝集素在豆科植物识别根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作用，通过豆科植物间凝集素基因的转化，可使一些豆科植
5、物识别原本不能识别的根瘤菌。但是，人们在利用人工启动子将豆科植物凝集素基因转化到非豆科植物时，并未能使非豆科转基因植株识别相应的根瘤菌。鉴于此，有必要在非豆科植物上模拟豆科植物凝集素的原始表达机制，研究非豆科植物与根瘤菌的相互作用。结瘤素基因（Nodulin Gene）是指特异地存在于根瘤菌感染产生的根瘤细胞中并参与共生固氮作用的植物基因，它们对于根瘤结构的形成及维持、固氮活性的保护以及固氮产物的代谢等都有重要作用。根据表达时间的先后，它可分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因。早期结瘤素基因在根瘤发育早期表达，参与“根瘤菌根毛”相互作用及根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之间的信息传递、根瘤菌的侵
6、染及根瘤的形成有着重要作用。目前已经发现了多个关键的早期结瘤素基因，并在一定程度上阐述了它们的功能，不过它们的工作机理仍有待进一步阐明。这些关键早期结瘤素基因在转化到非豆科植物中后，是否能发挥相应的功能，也需要进一步的探索。本实验通过 PCR 技术从豌豆基因组 DNA 中克隆出豌豆凝集素基因（psl）及早期结瘤素基因 PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40，构建了 psl 基因的植物表达载体 pVCT-PsL，并利用农杆菌介导法将 psl 基因导入烟草。主要实验结果如下：1psl 基因的克隆、表达载体构建及转化烟草以豌豆（Pisum sativum L.）基因组 DNA 为模板，
7、通过设计特异引物，利用 PCR 技术扩增获得 psl 基因。序列分析表明，该基因全长 1948 bp，包括编码 275 个氨基酸的 828 bp 的开放阅读框、854 bp 的 5端控制区和 266 bp 的 3端非翻译区。与已报道的序列（GenBank登录号 X66368）相比较，核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为 99.4%和 100%。将psl 基因插入到 pVCT2020，构建了该基因的植物表达载体 pVCT-PsL。利用农杆菌介导法将psl 基因导入烟草（Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38）中，共获得 10 个独立的卡那霉素抗西南大学硕士学位论
8、文- II -性烟草株系，移栽后全部成活并开花结果。PCR 检测初步确定 psl 基因已转入烟草基因组中。2豌豆 PsENOD12A 基因的克隆以豌豆基因组 DNA 为模板，通过设计一对特异引物，利用 PCR 技术扩增获得PsENOD12A 基因。序列分析表明，该基因全长 1282 bp，含有编码 110 个氨基酸的 333 bp 的开放阅读框和 936 bp 的 5端控制区。与 GenBank 公布的已知序列（X81366）相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为 99.9%(仅有 1 个碱基不同)和 100%。3豌豆 PsSYM10 基因的克隆以豌豆基因组 DNA 为模板，通过设
9、计特异引物，利用 PCR 技术扩增获得 PsSYM10 基因。序列分析表明，该基因全长 3310 bp，包括编码 594 个氨基酸的 1785 bp 的开放阅读框、1000 bp 的 5端控制区和 525 bp 的 3端非翻译区。与 GenBank 公布的已知序列（AJ575250）相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为 98.8%和 100%。4豌豆 PsENOD40 基因的克隆以豌豆基因组 DNA 为模板，通过设计特异引物，利用 PCR 技术扩增获得 PsENOD40 基因。序列分析表明，该基因全长 459 bp，包括编码 75 个氨基酸的 228 bp 的开放阅读框、117
10、bp 的 5端控制区和 114 bp 的 3端非翻译区，其翻译启始密码子不是常见的 ATG，而是稀有翻译启始密码子 TTA。与 GenBank 公布的已知序列（X81064）完全一致。关键词：豌豆；凝集素基因；早期结瘤素基因；PsENOD12A；PsSYM10；PsENOD40ABSTRACT- III -Isolation of Early nodulin Genes from Pisum sativum and Introduction of psl Gene into Nicotiana tobacum Master digree candidate Xiaoquan Zhou Advi
11、sor Xingguo Zhang（College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China）ABSTRACTLegume root nodule formation and symbiotic nitrogen fixtion are induced by rhizobia, which inoculate legumes specifically. The successive steps in root nodule development invol
12、ve a lot of host genes and rhizobium genes that express in this process. Former studies have showed that the leguminous lectins play an important role in the recognition of rhizobia. Some legumes could recognise the rhizobium that hadnt been recognized after the relevant lectin gene being introduced
13、. However, when lectin genes were introduced into non-legumes using manual promoter the anticipant result was not obtained. So, it is necessary to simulate the original mechanism of lectin genes expression, research on the interaction of transgenic non-legumes and rhizobia.The successive steps in ro
14、ot nodule development involve the induction of host genes that are not expressed in uninoculated roots. Of these genes, the genes that are not expressed in any other plant organ are named nodulin genes. Nodulin genes are very important for the formation legume root nodule , maintaining the function
15、of nitrogen fixtion and the metabolism of products. According to the expression time, nodulin genes were divided as early nodulin genes and late nodulin genes. Early nodulin genes were induced at the early stage of legume root nodule formation. It played an important role in the information communic
16、ation between plants and rhizobia, the process of infection and the formation of root nodule. So far several key early nodulin genes have been found, and some function of them were explained to some extent. Whether these genes would bring the same function after being introduced into non-legumes need to be made sure.In this study PsENOD12A, PsSYM10 and PsENOD40 gene, which are nodulin
