实验三革兰氏染色

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1、微生物学微生物学实验报告实验报告开课时间室：A 区文科楼 510 2012 年 11 月 29 日学院生物工程学院年级、专业、班10 级生工 01 班姓名吕亚慧成绩课程名称微生物学实验实验名称细菌简单染色法 革兰氏染色法指导教师李苹教师评语教师签字： 年 月 日 实验目的：实验目的：1 巩固油镜的使用方法；2 学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细菌的简单染色法；3 学习、掌握细菌的革兰氏染色法；4 建立“无菌操作”的概念，学习其技术。实验原理实验原理简单染色法：是利用单一染料对细菌进行染色的方法，常用碱性染料。只能观察微生物的大 小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。

2、复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色 法。常用的有：、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。 革兰氏染色法：G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解 了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。 G细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的 紫色。 光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结 构信息的光学仪器。 显微镜是利用凸透镜的放大成像原理， 将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的 尺寸，其主要是增大

3、近处微小物体对眼睛的张角 （视角大的物体在视网膜上成像大） ，用角放大 率 M 表示它们的放大本领。因同一件物体对眼睛 的张角与物体离眼睛的距离有关，所以一般规定像离眼睛距离为 25 厘米（明视距离）处的放大 率为仪器的放大率。显微镜观察物体时通常视角甚小，因此视角之比可用其正切之比代替。 显微镜由两个会聚透镜组成，光路图如图所示。物体 AB 经物镜成放大倒立的实像 A1B1，A1B1 位于目镜的物方焦距的内侧，经目镜后成放大的虚像 A2B2 于明视距离处。 实验器材实验器材变形杆菌、表皮葡萄球菌 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套、显微镜实验方法实验

4、方法1简单染色涂片 取一小滴蒸馏水于干净的载玻片上，用接种环挑取枯草芽孢杆菌菌体于水滴中，涂成 均匀的一薄层，在空气中自然干燥。固定 将载玻片有菌面向上，手持载玻片一端，迅速通过酒精灯火焰 23 次。染色 滴加染色液于载玻片的涂布区，染 23 分钟水洗 倾去染液，用自来水从标本表面未染色部分开始冲洗，经染色部分缓慢流下，直至冲 下来的水无色为止。干燥 用吸水纸吸净标本上多余的水，自然干燥。镜检 置高倍镜或油镜下观察细菌的形态。 2.革兰氏（Gram）染色涂片： 左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中 央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水

5、于载玻片中央，用接种环从 斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。 拔或塞试管塞时，应将试管 口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。固定：让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜） 。染色： （1）初染： 加饱和结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染： 滴加卢戈氏碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色： 将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用 95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现 紫色时为止，约 2030 秒，立即用水冲净酒精。 （4）复染： 用稀释石碳酸复红液染 0.

6、5-1 分钟，水洗。 镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细 菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 3.显微镜使用具体操作 实验时要把显微镜放在桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm 左右。 打开光源开关，调节光强到合适大小。 转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台 12cm 左右处，然后用左眼注视目镜内，接着调节聚光器的高度，把孔径光阑调至最大，使光线通过聚 光器射入到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。 将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央，然后用标 本夹夹好载玻片。

7、 先用低倍镜观察（物镜 10X、目镜 10x） 。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升， 物镜逐渐接近玻片。需要注意，不能使物镜触及玻片，以防镜头将玻片压碎。然后，左眼注视目 镜内，同时右眼不要闭合（要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯，以便在观察的同时能用右 眼看着绘图） ，并转动粗动调焦手轮，使载物台慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。如果在视野内看到的物像不符合实验要求（物像偏离视野） ，可慢慢调节载物台移动手柄。 调节时应注意，玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向，正好相反。如果物像不甚清晰， 可以调节微动调焦手轮，直至物像清晰为止。 如果进一步使用高倍物镜观察，应

8、在转换高倍物镜之前，把物像中需要放大观察的部分移 至视野中央（将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，视野中的物像范围缩小了很多） 。一般具有正 常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以 见到物像，但物像不一定很清晰，可以转动微动调焦手轮进行调节。 在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低， 使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线 强弱） 。 观察完毕，应先将物镜镜头从通光孔处移开，然后将孔径光阑调至最大，再将载物台缓缓 落下，并检查零件有无损伤（特别要注意检查物镜是否沾水沾油

9、，如沾了水或油要用镜头纸擦净） ，检查处理完毕后即可装箱。 实验结果记录及分析实验结果记录及分析图一：大肠杆菌革兰氏染色 图二：枯草芽孢杆菌革兰氏染色实验图片看出，大肠杆菌染色为红色，枯 草芽孢杆菌为紫色，可以验证大肠杆菌为革兰 氏阴性菌，枯草芽孢杆菌阳性菌。试验中对于 革兰氏染色的步骤我们也在理论层面上升到实 践层面，对我们的实验技巧等方面都有一定的 提高；试验中我们在进行大肠杆菌和枯草芽孢 杆菌染色的同时，也对我们之前在电梯中空气 自然沉降法获得的一种细菌进行了革兰氏染色， 其染色结果为球形的紫色细菌，说明该细菌为 革兰氏阳性菌。对于革兰氏染色实验，其存在 假阳性现象，但是此次试验我们是将三种细菌 同时进行染色，且其余两种，都表现出阳 图三：待测细菌革兰氏染色 性和阴性，故可以证明该细菌为革兰氏阳性菌， 而不是假阳性菌。当然对于其具体科属种还需进一步考证。