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1、NAD（P）H 氧化酶与胶质瘤恶性表型相关性研究氧化酶与胶质瘤恶性表型相关性研究负载供肾抗原的负载供肾抗原的 DC2细胞延长大鼠移植肾存活细胞延长大鼠移植肾存活观察观察（作者） 摘要：摘要：【目的】 检测 NAD（P）H 氧化酶及 ROS 在不同恶性程度胶质瘤中的表达，探讨 NAD(P)H 氧化酶及细胞内 ROS 对胶质瘤存活、增殖、凋亡以及恶性表型的影响。观察负载供肾大鼠抗原的 DC2（未成熟 DC）在体内特异性抑制急性排斥反应及其对移植 物的功能和存活时间的影响。【方法】体外制备并诱导分化未成熟的优势淋巴系 DC 前体 细胞（DC2） ，进行免疫表型分析，健康成年 BN 大鼠和 Lewis
2、 大鼠各 57 只，BN 大鼠为 供者，Lewis 大鼠为受者，随机分为 4 组，术前负载供肾大鼠抗原和无关供肾抗原，观察 DC2 体外抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的情况，构建大鼠同种异体肾移植模型，观察其 在体内特异性抑制移植排斥反应发生的情况，Kaplan-Meier 生存分析研究对移植物的存活 时间的影响。 【结果】所制备的 DC2 经供肾大鼠抗原负载对 MLR 具有抑制作用（P0.05），比值大于 0.2 时抑制作用差异 具有统计学意义（P0.05（表 5） 。 说明未负载抗原和负载无关抗原对肾移植大鼠远期存活率影响意义不大，只有输注负载供 肾抗原的优势 DC2 的才可明显延长远期存
3、活时间（附图 5） 。表表 4 各实验组肾移植术后生存时间各实验组肾移植术后生存时间Table 4 Survival time of each experimental group after renal transplantation组别只数 n生存时间（天）中位生存时间（天）95%可信区间实验组 11053,72,59,79,91,62,47,39,73,6662(51,73)实验组 21028,33,39,19,30,46,22,19,37,3430(22,38)实验组 31022,33,51, 14,27,38,18,23,36,2927(18,36)实验组 466, 10, 7,6,
4、9, 56(4,8)实验组 1 vs 实验组 2、3、4 有显著性差异， P0.05图图 2 各实验组肾移植术后生存分析曲线图各实验组肾移植术后生存分析曲线图Fig 2 Survival curve after experimental groups of renal transplantation2.2.3 血清血检测和组织病理切片结果血清血检测和组织病理切片结果 2.2.3.1 荧光定量荧光定量 RT-PCR 检测大鼠肾移植术后各组外周血单核细胞中各细胞因子（检测大鼠肾移植术后各组外周血单核细胞中各细胞因子（IL- 4、IL-10、IFN-）mRNA 表达水平表达水平 如图 5，细胞因子
5、IL-4、IL-10、IFN- mRNA 表达：实验组 1 vs 实验组 2、3、4 差异具有统 计学意义， P0.05。图图 3 移植后各实验组外周血单个核细胞的细胞因子移植后各实验组外周血单个核细胞的细胞因子 mRNA 表达图表表达图表Fig 3 Chart of peripheral blood mononuclear cells cytokine mRNA expression of each experimental groups after transplantation 2.2.3.2 移植后移植后不同实验组不同时间受者血清肌酐水平检测不同实验组不同时间受者血清肌酐水平检测 实验
6、组 1、2、3 和 4 受体鼠于术后第 5 天和实验组 1、2、3 受体鼠于术后第 14 天各 取下腔静脉抗凝血 2-3 ml 样本用生化分析仪测定肌酐水平，移植后第 5 天和第 14 天各组 血清肌酐水平（umol/L） ，实验组 1 与实验组 2、3、4 比较差异具有统计学意义，P0.05。图图 4 移植后各实验组在第移植后各实验组在第 5 天和第天和第 14 天血清肌酐水平的比较天血清肌酐水平的比较Fig 4 Compararation of serum creatinine levels of each experimental group on 5 days and 14 days
7、after transplantation 2. 2.3.3 移植后不同实验组的肾脏病理组织形态学观察移植后不同实验组的肾脏病理组织形态学观察 病理组织形态学检查提示，对照组出现急性排斥反应的病理改变，光镜下可见大量的 单个核炎症细胞浸润，肾小管坏死溶解改变明显，小动脉纤维素样坏死，甚至有些肾小球 出现出血型炎症；实验组 1 病理示肾小球、肾小管结构正常，未见静脉充血或者动脉出血， 仅有少量灶性的单核细胞浸润；未见纤维化改变，偶有间质轻度水肿，无间质出血和肾小 管的坏死。实验组 2 和实验组 3 病理改变接近相似，仅间质浸润的单核细胞较负载供肾抗 原 DC2 组稍增多，也无间质出血和肾小管的坏
8、死。实验组-1 5th Day -X200 实验组-1 14thDay X200 实验组-1 14thDay X400 实验组 2 5th Day X400实验组-2 14th Day X400 实验组-3 5th Day X400 实验组-3 14th Day X400 实验组 4 5th Day X400图图5：肾移植术后第：肾移植术后第5天和第天和第14天病理切片天病理切片Fig 5 The athological pictures on 5 and 14 days after kidney transplantation3 讨讨 论论3.1 不成熟 DC2 的制备及意义同种异体移植排斥
9、反应是当前器官移植领域所急需解决的最大难题，诱导受体抗原特异 性免疫低下状态或免疫耐受是同种异体器官移植追求的理想目标。研究表明通过影响 DC 的成熟过程可以起到间接调节免疫反应的作用，这为探索预防和治疗临床上急、慢性移植 排斥反应提供了一个新的思路。由于 DC 重要的免疫学功能，因此如何获得大量的纯化的 DC 就成为进一步研究 DC 特性及功能的前提。本研究通过 GM-CSF+IL-4+SCF+Flt3L 四种 细胞因子组合在体外诱导骨髓造血干细胞制备出耐受性 DC2，第 3 天可以获得大量的 DC2细胞，纯度高达 94.87，流式细胞仪检测的结果表明，采用上述四种组合细胞因子诱导所 产生的
10、主要是未成熟的 DC2，表面低表达的 MHC类分子（OX6）和协同刺激分子 （CD40、CD86）提示其主要具备免疫抑制或者诱导免疫耐受为主的功能。3.2 负载供肾抗原的优势 DC2 体外抑制 MLR 的功能MLR 实验表明，负载供体抗原的不成熟 DC2 对 MLR 均具有明显的抑制作用，与其他 实验组和对照组之间有显著性差异（P0.05）。DC 诱导移植免疫耐受的可能机制包括: 诱导调节性 T 淋巴细胞的产生，主要包括诱导 CD4+ CD25+ T 淋巴细胞的生成12-13，后 者可能对移植免疫反应有抑制作用；诱导 T 淋巴细胞无能，清除或者凋亡诱导免疫偏 移14-15,即诱导免疫反应从 T
11、h1 型向 Th2 型转变。本实验的 DC2 细胞特异性抑制移植排 此反应，其机理可能与诱导免疫偏离和其产生的细胞因子有关，与文献报道的 DC2 的功能 也相符合 16-17。3.3 负载供肾抗原的优势 DC2 防治大鼠肾移植急性排斥反应的体内实验观察在同种异体移植肾存活时间研究中以 BN 大鼠为供体， Lewis 大鼠为受体，建立了大 鼠肾移植急性排斥反应模型，从生存分析曲线中可知输注负载供肾抗原的优势 DC2 可明显 能特异性地延长移植大鼠的远期存活时间，为 DC2 建立过继性和特异性免疫耐受预防急性 排斥反应提供了直接有效的证据18。相对于负载无关抗原 DC2 组（303.95 天）、单
12、纯 DC2 组（274.74 天）和空白对照组比较，虽然这两者也可以延长大鼠肾脏移植的存活。 综上所述，体外培养诱导出大鼠不成熟淋巴系 DC（DC2），进行同种异基因大鼠肾移植， 在肾移植前输入 DC2 细胞能显著减轻移植排此反应，在大鼠同种异基因肾脏移植的同时输 注负载供肾抗原的优势 DC2 具有预防和抑制急性排斥反应的发生，达到免疫耐受的效果， 可延长生存时间，提高远期存活率。本研究结果为人 DC2 细胞过继免疫诱导肾移植耐受的 应用研究打下了坚实的基础，提供了有力的理论和实验依据。参考文献：参考文献：1Gilliet, M. and Y.J. Liu, Human plasmacytoi
13、d-derived dendritic cells and the induction of T-regulatory cellsJ. Hum Immunol, 2002. 63(12): p. 1149-55. 2 Gmez J, Borrs FE, Singh R, et al., Differential up-regulation of HLA-DM, invariant chain, and CD83 on myeloid and plasmacytoid dendritic cells from peripheral bloodJ. Tissue Antigens, 2004. 6
14、3(2): p. 149-57. 3Chaussabel, D. and J. Banchereau, Dendritic cells, therapeutic vectors of immunity and toleranceJ. Am J Transplant, 2005. 5(2): p. 205-6. 4 Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, et al., Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by
15、 repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cellsJ. J Exp Med, 2000. 192(9): p. 1213-22. 5 McCurry KR, Colvin BL, Zahorchak AF, et al., Regulatory dendritic cell therapy in organ transplantationJ. Transpl Int, 2006. 19(7): p. 525-38. 6Morelli, A.E. and A.W. Thomson, Dendritic ce
16、lls: regulators of alloimmunity and opportunities for tolerance inductionJ. Immunol Rev, 2003. 196: p. 125-46. 7 Lutz MB, Suri RM, Niimi M, et al., Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivoJ. Eur J Immunol, 2000. 30(7): p. 1813-22. 8纳宁，罗云，洪良庆，等。四种细胞因子组合从小鼠骨髓细胞体外诱导优势不成熟纳宁，罗云，洪良庆，等。四种细胞因子组合
