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1、中药学研究技术进展摘要: 中药作用的基础是其化学物质组成。利用现代科技 , 阐明中药化学物质基础 ,实现中药现代化是中医药研究的一项重要内容。但由于中药成分复杂, 这也是目前研究中的难点和关健。 色谱联用技术集成了色谱和结构鉴定的光谱手段之优点,是当前最为引人注目的一种新型分析手段, 对于中药复方这样复杂混合物的分析具有十分重要的意义。色谱联用技术包括气相色谱质谱联用、气相色谱红外光谱联用、液相色谱质谱联用、液相色谱核磁共振波谱联用和液相色谱与串联的核磁共振波谱、 质谱、质谱联用。 利用微柱液相色谱 （甚至毛细管液相色谱）和大气压下接口（电喷雾接口和大气压化学电离接口）的软电离多级质谱（包括离
2、子阱质谱、三级四级杆质讲和四级杆与飞行时间质谱的串联质谱）联用是最为引人注目的发展方向。 文中以大川芎方为例对色谱质谱联用技术的应用前景进行了初步探索。关健词 : 中药复方色谱联用技术大川芎方中药现代化是目前我国医药科研人员和产业化所面临的重大任务。我国传统中医药使用方剂（中药复方）治病, 注重宏观整体作用 , 这是其与西医药相比较的优势所在 ,但限于时代和认识手段 , 我国中医药对治病的化学物质基础和分子水平的治病机理等微观过程认识相对不足。中药现代化过程中一项很重要的任务就是, 利用现代医学、化学、药学、计算机信息学等各项现代自然科学的最新方法和技术 , 从微观分子水平认识和发展中医药理论
3、, 研制出现代中药复方新药。 这些新药的主要特征之一就是安全、有效、方便、高效、速效、长效。中药治病必然有其化学物质基础, 从分子水平研究中药疗效、药理作用和配伍规律必须首先弄清作用的主要成分, 而现代中药的质量控制、生产工艺和各种新剂型的研究和开发更离不开其化学成分的提取、分离、精制, 以及跟踪、识别和定量。中药是一个非常复杂的体系,中药复方提取物是一个非常复杂的混合物,常常含有从无机物到有机物；从离子性、强极性到非极性；从小分子到生物大分子从位置异构体到对映体从常量到痕量的各种成分。这些成分常常包含黄酮、皂贰、有机酸、生物碱、挥发油、糖和蛋白质等不同类有效成分, 每一类化合物又常含有很多结
4、构类似的化合物（如异构体化合物）, 性质相似，共同组成一个难于定性和定量的复杂混合物。 因而中药复方化学物质基础的研究也是目前中药现代研究中的一个难点和重要研究内容。一、色谱联用技术是阐明中药复方化学物质基础的皿要技术和方法对于中药化学成分研究,传统的方法是采用溶剂分配和柱色谱方法将其逐一分离为纯的单一化合物 ,然后进行结构鉴定。 应用这种方法 , 很多中药成分得以阐明。这一技术在中药化学成分的研究上取得了丰硕成果, 但这样的分离分析由于步骤多、分离效率低、自动化程度低，一方面比较费时，另一方面对微量组分常十分困难。而且这样做常常将中药复方整体割裂为几个（或几十个）含量比较高的有效成分 , 忽
5、视其间的准确含量比例（化学指纹特征）和一些含量少的组分。现代高效色谱为一次实验同时分离多种组分提供了很好的手段, 但色谱对化合物的定性则常常无能为力 ,当其用于分析手段时 , 必需提供标准对照品才能进行保留值的比对定性和定量 ,对于大量未知化合物的定性常常是其美中不足之处。因此, 色谱和各种光谱手段的联用技术一直是现代仪器分析所追求的目标。研究分析中药这样复杂的混合物更是离不开色谱联用技术。色谱联用技术综合了成分分析的色谱和结构鉴定的光谱手段的优点, 使得对化学成分混合物的研究能力大为增强。对于不纯化合物的鉴定可以很容易利用高效色谱分离后进行鉴定, 提高鉴定的可靠性 , 而对于混合物体系则可以
6、充分利用色谱高效分离能力和光谱手段的定性能力进行混合物定性及定量研究, 完成以前所不能解决的问题。色谱联用技术由于色谱和各种光谱、质谱手段的多样性, 因而包含了各种各样的联用方式和技术。现代高效色谱主要以气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳等技术为主 ,这几种色谱手段同四大谱（质谱、核磁共振、红外、紫外光谱）的分别联用自然组成了色谱联用技术的丰富内涵。由于色谱使用流动相, 而这些流动相大多在光谱分析中不能被接受, 因而解决流动相问题自然成为联用首先要解决的问题。但即使如此 , 由于光谱手段灵敏度并不十分高, 色谱如何与光谱、质谱联用也不是很容易的事, 四大谱与色谱的联用呈现出不同的发展步伐。总的
7、来说, 由于对分析要求的日益增高和各种微量、制备规模液相色谱及光谱、电子计算机技术的发展 , 每种联用均得到较大发展。其中最引人注目的当属色谱与质谱的成功联用 , 如气相色谱质谱（ GC-MS ）和液相色谱质谱（ CL-MS ）。多波长紫外检测器本身即是利用紫外光谱的特性, 因而随着光电二极管技术的发展, 液相色潜光电二极管阵列紫外扫描式检测器（LC-PDA ）,已成为代替常规多波长紫外检测器的很常用的仪器。 液相色谱光电二极管阵列紫外扫描式检测器对分离的色谱峰均可以获得其在流动相中的紫外光谱图,以用于定性分析一些紫外特征的化合物 ,以及对选择合适、灵敏的紫外吸收波长进行定量分析。对于未知化合
8、物可以利用每一点下最大吸收波长吸收值组成高灵敏、自适应未知化合物最大吸收波长的色谱图 , 如类似色谱质谱联用中的基峰色谱图。随着高频、高灵敏、快速超导核磁共振仪器仪的发展, 液相色谱与核磁共振的联用（CL-NM ）R也逐步得到发展。除此之外 , 气相色谱与付利叶变换红外光谱（GC-FIRR ）、液相色谱与电感祸合等离子体质谱（Lc-ICMPS ）、薄层色谱与质谱（ TLC-MS ）也可以联用。几种光谱手段的串联则进一步扩大了色谱联用的范围,其比较成功的例子包括液相色谱一光电二极管阵列紫外扫描一质谱（LC-PDA-MS ）, 液相色谱一核磁共振一质谱（CL-NMR-MS）, 以及质谱一质谱与液相
9、色的联用, 如 LC-MS-MS （QqQ ）,LC-MS ,LC-Q-Tof 等。二、色谱质谱联用技术的发展及应用实例1. 色谱质谱联用技术色谱和质谱的联用是目前最受重视的手段。80 年代气相色谱已非常成功地与质谱联用 ,并且随着小型台式四极质谱的发展, 质谱已成为气相色谱工作者的很好的有一定定性功能的检测器, 在一些中药挥性成分的研究中也得到了广泛的应用。应用高效毛细管气相色谱进行上百个成分的分离, 同时进行其质谱测定 , 利用标准质谱库再加以匹配、识别和定性已是很常规的事。到目前为止,色谱与质谱联用技术的发展主要体现在液相色谱通过各种连接接口与各种质谱的联用上。这是因为尽管毛细管气相色谱
10、一质谱有很强的分离及定性能力, 但对于药物研究（如中药复方提取物）中大多数成分, 由于其不挥发性而需要用液相色谱来进行分离分析 ,就自然需要利用液相色谱一质谱联用技术进行分离及定性研究。要想将液相色谱与质谱很好联用必须解决好来自于色谱和质谱两方面的间题, 这主要包括液相色谱液体流动相的去除, 质谱灵敏度、稳定性的提高和质谱体积、成本的降低。去除液相色谱流动相的最常用方法是将其挥发去除, 但当液相色谱流动相含水量较高、含有缓冲盐和流速较高时, 这也不是一件容易的事。因此发展液相色谱与质谱联用技术的接口一直是其关键技术之一和阻碍因素, 直至 90年代初发展出大气压下的液相色谱和质谱的联用接口（电喷
11、雾接口（ESI）和大气压下化学电离接口（ APCI）之前 ,液相色谱与质谱的联用一直步履艰难。大气压下的液相色谱和质谱的联用接口电喷雾接口（ESI）和大气压下化学电离接口（ APCI ）是利用气体辅助（或加高压）下流动相进行喷雾, 将溶剂挥发除去 , 同时流动相中的溶质分子在大气压下进行电离。这种方式在很大程度上解决了使用 LCMS时对液相色谱流动相的限制（如对纯水和流速的限制）, 灵敏度也得到很大提高。并且这是软电离的方式, 主要产生的是“拟”分子离子峰。进一步使用多级质谱 , 可以很好对未知化合物的结构进行研究, 这正迎合了液相色谱质谱联用时对软电离的要求（如传统方式以FAB MS方式来进
12、行）。而利用 MS MS进行选择反应临测（ SRM ）则具有很高的选择性 ,因而具有很好的定量灵敏度和可靠性。围绕上述思想, 不同公司均进行了自己的专利设计以进一步改善接口的去溶剂、抗污染和增加离子采样率和离子传输性能。几种典型的接口包括 iFnnigan 公司的加热金属毛细管接口PE公司的反吹气帘式接口、Mieomass（Waters）公司的 z 型喷雾接口和 Bmker（Agilent ）公司的正交喷雾接口。除液相色谱和四极质谱的联用之外, 利用大气压下的接口 , 液相色谱、毛细管电泳与最新发展的离子阱质谱和正交飞行时间质谱也实现了成功联用。液相色谱一离子阱质谱联用 （如 LCQ ）可以容
13、易地进行多级质谱测定, 从而确定其分子量和相关的结构信息。 相比较四极杆质谱 ,飞行时间质谱具有更高的灵敏度和分辨力,基于电喷雾接口的液相色谱一正交飞行时间质谱联用不仅能对色谱流出组分进行高灵敏度检测 , 而且是一种准高分辨质谱, 能进行准确的分子量测定, 从而可能直接给出化合物的分子式。 除此之外 , 飞行时间质谱具有更高的扫描速率, 现在已有一台飞行时间质谱连接八根液相色谱柱的商品化产品。将四极杆质与飞行时间质谱组成串联质谱产 , 结合最新发展的毛细管液相色谱技术组成的CapLC Q TofMS MS将集成高效毛细管液相色谱、四级质谱与飞行时间质谱的优点成为当前解决复杂样品分离分析的最尖端
14、工具体之一。2. 大川芎方的色谱一质谱用分析初探随着色谱一质谱联用技术（尤其是大气压下液相色谱质谱联用技术）的发展 ,其应用正日益拓展 , 从最开始少数由质谱研究人员应用为主而逐渐发展为质谱工作者、药物化学家、环境化学家等多数人应用的工具, 其应用面包括药物分析（药代）、药厂快速含量测定、环境分析、生化分析、天然产物分析等各个方面。我国随着仪器的采购 ,应用工作也逐渐发展开 , 其中一个很重要的方面即应用于中药化学成分的研究。下面以大川芎方为一例子, 简单讨论一下其应用前景。大川芎方由川芎和天麻两味药组成, 主要成分包括有机酸、生物碱、内醋、挥发油、贰类、多糖等。为了深人对其化学成分进行研究,
15、 还需进行其化学成分的系统分离分析研究。由于川芎含有大量挥发油,首先利用水蒸气蒸馏提取其挥发油进行气相色谱一质谱分析, 利用 OV一 1 柱和梯度程序进行分离 ,获得其总离子流色谱图。 从图中可见 , 川芎中含有很多种挥发性成分, 其中有两个比较大的峰 ,对这两个比较大的峰 , 经与标准谱图库匹配和质谱规律验证, 可以确定最大的色谱峰为篙本内醋 , 另一峰为三丁基苯酞 , 这与文献所述一致 ,对于其他峰的质谱研究可以发现其中含有这两种化合物的类似物, 也可能还有不饱和脂肪酸。对于大川芎方中大量有效成分（如阿魏酸、盐酸川芎嗓、天麻贰等）还必须采用液相色谱一质谱进行分析。对于大川芎的提取物, 采用
16、微柱液相色谱（ 2.1mm 内径柱）和大气压下电喷雾质谱同时在正负离子模式下进行了扫描分析, 得到基峰色谱图。从质谱图的分子离子峰和其与醋酸的加合离子峰可以判断天麻贰峰和阿魏酸峰。进一步用标样验证, 保留时间和质谱图均十分吻合。但对于其中的其他未知化合物还要通过源内碰撞诱导裂解（源内 CID）和二级质谱 , 利用质谱断裂规律, 进行其结构解析 , 很多时候还需要利用其他手段进行综合分析。色谱一质谱联用技术是一项还在发展着的新技术,以上所述只是非常简单的例子, 其在中药复方中的应用还有大量的工作有待于深人研究。参考文献1甘师俊 ,李振吉 ,邹健强 .中药现代化发展战略 .科学技术文献出版社 .北京:1998 2肖红斌 ,梁鑫森 ,卢佩章 .中药复方分析新方法及其应用.科学能报 ,1999：44（6）:588 3卢佩章 ,梁鑫森 ,肖红斌 .复杂样品的分离分析 ,见:汪尔康编 ,面向二十一世纪的分析化学.北京:科学出版 ,200。4Niessen,WMA.J.Columatgr.A.1999,856:179 5hTermoqu
