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1、实验五实验五 底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响实验人：刘彦汶实验人：刘彦汶 学学 号：号：20100331024 班班 级：针外级：针外 2010 七七 同组人：严安、曲畅同组人：严安、曲畅 实验日期：实验日期：2012-4-25 指导老师：路雪雅指导老师：路雪雅一、一、实验目的实验目的1、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验原理。 2、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验方法。二、二、实验原理实验原理碱性磷酸酶可以催化水解底物分子的磷酸基团。本实验用大鼠肾脏碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，水解反应如下：水解产物苯酚与酚试剂
2、反应呈色，产物可以在 660nm 波长下比色，以检测苯酚浓度，从而确定反应速度。（一）（一）底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响当酶量不变时，增加底物浓度，在初期，反应速度显著增加，当底物浓度增加至一定量时，反应速度增加缓慢，继续增加底物浓度时，反应速度不再增加，这说明所有酶发挥了最大效用，底物的量已过剩。将米氏方程两边取倒数所得到的双倒数方程式称林-贝氏方程：1/V=(Km/Vmax)1/S+1/Vmax在林-贝氏方程中，1/V 与 1/S称线性关系。以 1/V 对 1/S作图得到一条直线，其斜率是 Km/Vmax，在纵轴上的截距为 1/Vmax，在横轴上的截距为-1/K
3、m。应用双倒数作图法可以求酶的 Km 值。（二）（二）酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时 反应速度与酶浓度成正比，本实验可以帮助检查酶促反应条件的准确性和 可行性。三、三、实验器材实验器材试管、定量移液管、水浴锅、分光光度计四、四、实验试剂实验试剂PH 为 10 的缓冲液、3、6、12mmol/L 底物液、 （1:4000）酶液、酚试剂、0.5mol/L 碳酸钠五、五、操作步骤及结果操作步骤及结果（一）（一）底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响按下表操作试剂（ml）管号123456pH10.0
4、 缓冲液0.50.50.50.50.50.53mmol/L 底物液0.16mmol/L 底物液0.112mmol/L 底物液0.10.30.5蒸馏水0.50.40.40.40.2酶液（1:4000）0.50.50.50.50.50.5底物浓度 mmol/L0020.40.82.44.0混匀后，370C 保温 15 分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.50.5mol/L 碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，370C 保温 15 分钟混匀后，以 1 号试管为空白对照管，用 660nm 波长比色，测定各管吸光度底物浓度倒数L/mmol5.002501.250.420.25A00
5、.3040.3860.4870.5490.6101/A03.292.592.051.821.64以吸光度倒数为纵坐标，底物浓度倒数 L/mmol 为横坐标作图，求米氏常数实验所作图如下（二）（二）酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响按下表操作 试剂（ml）管号12345 pH10.0 缓冲液0.50.50.50.50.5 12mmol/L 底物液0.50.50.50.50.5 蒸馏水0.5 0.40.30.20.1 酶液（1:4000）0.10.20.30.4 混匀后，370C 保温 10 分钟 酚试剂0.50.50.50.50.5 0.5mol/L 碳酸钠3.03.03.03
6、.03.0 混匀后，370C 保温 15 分钟 混匀后，以 1 号试管为空白对照管，用 660nm 波长比色，测定各管吸光度 酶浓度（1:4000） 1501234A00.1390.1980.2370.305 以吸光度为纵坐标，酶浓度（1:4000）15 为横坐标作图，观察反应速度和酶 浓度的关系 【附注】 1 号试管是空白管不加酶液（在酶浓度试验中，应同时做相同的不同酶浓度的 对照管，以校正酶液本身可能存在天然酚含量，但在本实验中，所用酶液中天 然酚含量较小，可略去不计） 实验所作图如下实验所作图如下六、六、结论及讨论结论及讨论结论结论 1、 根据所作图，又由于吸光度 A 反映的是酶促反应的速率的快慢，即 A 与反应速度成正比，由此可推知 1/V 与 1/S称线性关系。以 1/A 对 1/S作图得到一条直线，其在横轴上的截距为-1/Km。应用双倒数作图 法可以求酶的 Km 值。由图可求出 Km=0.20 2、 当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此 时反应速度与酶浓度成正比。 讨论讨论 1、 由于坐标纸不够充裕而使作图不够精确，最终使作图所求 Km 值产生误 差。 2、 由于分光光度计本身的误差而使实验所得数据有一定的误差。
