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1、凋亡信号和免疫微环境对树突状细胞的免疫调控作用( 中文摘要)免疫自稳是免疫应答的最重要的特征之一，它保证了免疫应答的自限性，即当外来病原体或者抗原被机体清除后，免疫应答会逐渐减弱直至恢复至免疫系统的静息状态，以维持机体的相对的平衡，这提示机体必然存在相应的正负反馈调节机制来实现这一功能。在免疫应答过程中，抗原递呈细胞发挥着桥梁的作用，连接着外来的抗原的识别和相应的效应细胞的应答。而树突状细胞( D e n d r i t i cc e l l s ，D C ) 是目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞，具有直接刺激初始T 细胞增殖的独特功能。它们主要以非成熟状态存在于非淋巴组织内，此时，获取抗原
2、是其主要功能。当外界的病原微生物或其它异物侵入机体，D C获取抗原，迁移至外周免疫器官中在此过程中，D C 获得成熟，主要表现为抗原摄取能力降低，而抗原递呈功能增强。在外周免疫器官中，D C 将抗原递呈给T 细胞，从而激发免疫应答。根据机体的免疫自稳的原则，D C 不可能持续地活化T 细胞，那么，完成了抗原递呈功能的D C ，其最终命运是怎样的呢? 目前的研究表明，D C 在活化T 细胞的同时，亦受到来自于T 细胞的作用，引起自身的凋亡，以有效地下调免疫应答。目前普遍认为，成熟D C在完成抗原提呈功能而激活T 细胞之后，通过自身发生凋亡而实现免疫负向调控。但是，由于免疫应答都是在外周免疫器官的
3、微环境中进行的，而免疫微环境由基质细胞和细胞外基质组成，含有众多的膜分子和可溶性的细胞因子，因此，外周免疫器官特殊的微环境在为免疫应答的进行提供良好条件的同时，也必将对参与免疫应答的细胞的功能状态和命运有所调节。因此，脱离基质微环境的影响而研究和谈论免疫细胞在应答后的命运归宿，所得到的结论不可能反映在体的真实情况。有实验证实，在不需要外来细胞因子的作用下，脾脏基质长期培养体系( L T C ) 中，可诱导造血前体细胞产生D C 样细胞，具有D C 的形态和功能。也有研究发现，肺部、脑组织和肾脏内的D C 在微环境的作用下，其功能发生变化，成为具有调节性作用的D C ，我们以前的实验也证明，用来
4、源于脾脏的内皮型基质细胞E S S C来模拟免疫微环境，将成熟D C 与其共培养后，成熟D C 获得了继续增殖的能力，而且，其功能也发生了质的变化，由原来的刺激T 细胞增殖变成只能诱导T 细胞活化而不能刺激其增殖，而且可以抑制成熟D C 诱导的T 细胞的增殖。这提示免疫微环境对于D C 的分化发育和功能具有很强的调节功能。细胞凋亡是细胞维持机体内环境稳定的机制之一，一旦细胞凋亡发生异常，机体将发生肿瘤、自身免疫性疾病等等。也有实验证明，不同器官的微环境或者通过基质细胞表面的分子或者通过分泌的可溶性因子，有助于不同类型的细胞免于凋亡( 其实，实验中仅仅是观察对于细胞凋亡的预防作用) 比如，胸腺的
5、上皮细胞可以抑制皮质激素引起的胸腺细胞2墨三垩墨丕兰堡主茎堡丝兰一一的凋亡，骨髓的基质细胞可以通过分泌C X C L l 2 与慢性B 细胞淋巴瘤表面的C X C R 4 作用而阻止B 细胞的凋亡，表达的血小板内皮细胞黏附分子1 ( P E C A M - 1 ) 和A 4 使造血前体细胞免于凋亡，基质细胞可以阻止1 L 2 撤退性T 细胞塌亡，1 F N - p 参与其中，肺部的戌纤维细胞可以通过P G E 2 依赖的方式抑制活化诱导的T 细胞死亡。这些研究表明，器官微环境在保护细胞免于凋亡方面发挥了重要的作用。但是，到目前为止，尚来见免疫微环境对已经发生凋亡的免疫细胞的调节作用。根据我们以
6、往的工作基础以及免疫器官微环境对免疫应答的可能调控作用，我们推测，尽管有实验证实D C 在发挥完功能后发生凋亡，免疫微环境可能会对凋亡的D C 发挥调节作用，从而使D C 抵抗凋亡或者不易于发生凋亡，也因此与D C的体内数量极少但功能强大的特性相适应。为了研究在免疫微环境中D C 的命运，我们利用本室建立的来源子小鼠脾脏的基质细胞E S S C 模拟体内的微环境，建立在免疫应答过程中D C 凋亡的模型，然后将凋亡的D C 利用分选流式细胞仪接种至预先铺好E S S C 的培养板中，观察D C 的各种生物学性状的变化。我们的实验结果显示，体外用远远超过体内可能情况的大剂量的L P S 加上C H
7、 X 处理D C ，或者将D C 与抗原特异性T 细胞共培养，或者用I F N 7 与抗M H CI I 类分子抗体处理D C ，都可以诱导D C 凋亡。利用A n n e x i nV J e - 1 7 A A D ( 或A n n c x i nV f R 1 2 3 7 A M 3 ) 标记，可以将凋亡D C 分为早、中、晚三期，A n n e x i nV + R 1 2 3 6 吐7 A A D 为早期凋亡D C ，A r m e x i n扩R 1 2 3 ”7 A A D - 为中期凋亡D C ，而A n n e x i nV + R 1 2 3 7 A A D + 为晚期凋亡
8、D C 。利用分选流式细胞仪分别将其分选至内皮样基质细胞E S S C 单层细胞上或含有G M C S F I L 4 的培养基后，结果发现，凋亡早期的D C 在含有G M - C S F 肛一的培养基中就可以重新存活，但凋亡中晚期的D C 在含有G M - C S F I L - 4 的培养基中不能存活，表明含有G M C S F I L 4 的D C培养基可以逆转凋亡早期的D C ，但是无法逆转凋亡中晚期的D C 。令人兴奋的是，但凋亡中期的D C 被分选接种至E S S C 上后，约7 0 的凋亡D C 可以被逆转，其中8 0 可以获得增殖形成单克隆。而且，逆转后的D C 的超微结构发生
9、了变化，当与E S S C 共培养2 4 小时后，凋亡D C 肿胀的线粒体恢复至正常形态，而4 8 小时后，细胞完全恢复至正常。但是，凋亡晚期的D C 分选至E S S C 后，也不能被逆转。表明基质细胞可以逆转早期和中期凋亡的D C 井促进其增殖。进一步研究发现，这些逆转并增值的D C 的表型发生了明显的变化，主要表现为M H Cc l a s sI I 、C D 4 0 、C D 8 6 及C D I I c 降低至阴性表达，而C D l l b 表达无明显变化，其刺激T 细胞增值的能力显著降低，而且可以抑制成熟D C 诱导的抗原特异性T 细胞的增殖，提示其具有负向调节免疫应答的作用。免疫
10、微环境逆转D C 凋亡的意义主要有三点：一是我们的实验证明- 当凋亡发生至某些阶段后，确实可以被逆转。目前关于凋亡调控的研究主要集中于细胞内部的基因调控，主要包括c a s p a s c s 、B c l 一2 家族、p 5 3 蛋白、c M v c蛋白和I A P s 等，它们可以促进凋亡的发生或者抑制凋亡的进行。但是，目前尚无实验证明，3丝三至曼丕堂竖主堂堡堡苎当凋亡进展到一定程度以后，是可以被逆转的。因而，当机体受到某些一过性的损伤时，可能某些细胞进入凋亡进程，但当损伤撤除后，某些凋亡细胞继续发展下去，而某些细胞则可以被逆转，重新发挥功能。譬如脑组织和心脏经历一过性的缺血后，在一定的时
11、间内是可以恢复的有可能这种凋亡细胞的可逆转性在其中发挥了重要的作用。二是免疫微环境在凋亡D C 的逆转过程中发挥了重要的作用。有研究者报道，微环境在D C 的分化发育过程中发挥重要的作用，而且，不同部位的微环境还可以使不同类型的细胞免于发生凋亡。我们以前的研究结果也证明，免疫微环境可以促使成熟的D C 获得进一步增殖能力。这些结果都说明，微环境具有对凋亡细胞发挥效应的基础。根据我们的实验结果，如果在体内免疫微环境可以逆转部分凋亡D C ，这必然对免疫应答的进展具有很强的调控作用，也与D C 本身数量很少但具有很强的生物学功能相适应。三是逆转后D C 的功能发生了变化，获得了负向免疫调节功能。这
12、与我们以前的成熟D C 与E S S C 共培养后的功能结果一致，提示免疫微环境可以通过对不同功能状态的D C 的调节，使其在完成抗原递呈功能，促进免疫应答发展到一定程度后，转变为具有调节作用的D C ，从而下调免疫应答，在清除入侵抗原后，能够使免疫应答恢复至基础水平，从而避免了免疫系统的过度活化后对机体可能造成的损伤。在寻找一种台适的方法诱导D C 凋亡的过程中，我们首先应用经典的凋亡诱导分予F a s L或抗F a s 抗体来处理D C ，以期能够诱导D C 凋亡。但结果发现，F a s L 或抗F a s 抗体非但不能诱导D C 凋亡，反而可以促进细胞因子I L - 1 8 的分泌，诱导
13、D C 表型和功能成熟，而这种F a s 信号诱导的D C 的成熟是自分泌的I L 1 B 依赖性的。进一步探讨其机制后发现F a s 信号可以活化E R K l 2 、N F - K B 和c a s p a s el 。E R K l 2 信号传导通路主要参与I L 1 D 及多种趋化因子的分泌和D C 的成熟，而F a s 信号活化N F - K B 信号传导通路是D C 抵抗F a s 的凋亡诱导作用的机制之一。C a s p a s e l 主要决定了F a s 信号诱导D C 也1 口的分泌( G u o Ze t a l ，B l o o d ，2 0 0 3 ，1 0 2 ，4
14、 4 4 1 - 4 4 4 7 ) 。考虑到趋化因子在机体炎症和免疫反应中起重要的作用，而且象D C 一样，趋化因子也是连接天然免疫与适应性免疫的桥梁，因此，为了进一步探讨F a s 信号的炎症效应的机制，我们通过第二部分实验研究了F a s 信号诱导D C 的趋化因子的分泌，并对其生物学功能和信号传导途径进行了的研究。发现F a s 信号可以显著诱导D C 分泌多种C C 和C X C 类趋化因子，能够在体内和体外趋化T 细胞和中性粒细胞，并能够促进抗原特异性的T 细胞的增殖和中性粒细胞的吞噬功能，表明F a s 信号通过促进D C 分泌趋化因子而更好地连接天然免疫应答和适应性免疫应答。F
15、 信号可以显著诱导D C 分泌多种C C 和C X C 类趋化因子的发现具有重要的生物学意义。F a s L 表达于活化的T 细胞、某些肿瘤细胞、肝脏和小肠的非淋巴细胞以及某些免疫赦免部位，包括睾丸、眼睛及胎盘。而F a s 广泛表达于多种细胞类型，包括D C 。在不同的生4丝三兰匿盔兰壁主兰垡堡墨一一理和病理情况下，这些表达F a s L 的细胞会有机会与D C 接触。作为抗原递呈细胞，被初始的炎症刺激活化的D C 摄取并处理外来抗原后，迁移至淋巴结将抗原递呈给T 细胞，触发了T 细胞的活化和增殖。活化的T 细胞随后迁移至炎症部位，发挥效应细胞的功能，清除抗原。在此过程中，表达在活化T 细胞
16、表面地F a s L 不可避免地将与D C 接触。我们的结果表明，F a s L 不能诱导D C 的凋亡，这可能与D C 作为功能最强的抗原递呈细胞的特性及其体内数量极少相适应的。而且，F a s L 通过诱导I L l D 的分泌促进D C 的成熟，使其更好地递呈抗原，正向调节免疫应答。而且，有报道表明F a s L 在外周C D g + 和C D 4 + T 细胞增殖的过程中发挥共刺激分子的作用，表明A P C 表面的F 与T 细胞表面的F a s L 之间的相互作用在精确调节T 细胞和A P C 功能方面发挥着重要的作用。而且，我们的实验结果表明，F a s 刺激D C可诱导多种趋化因子的分泌，招引更多的初始T 细胞并促进它们的活化和增殖，从而增强获得性免疫应答。而且，在炎症部位，如我们的结果所示，F a s 与F L 相互作用后可以趋化更多的活化T 细胞和吞噬细胞并促进中性粒细胞的吞噬功能，同时增强获得性免疫应答和初始免疫应答。另外，表达于免疫豁免部位的基质细胞和肿瘤细胞上的F a
