《乳腺癌血管新生的细胞周期蛋白调控及蛋白质光学芯片临床应用的探索》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乳腺癌血管新生的细胞周期蛋白调控及蛋白质光学芯片临床应用的探索（177页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学博士学位论文英文缩写英文全称中文全称V E G Fb F G FB P BC D KC C MD T T2 D EE C C ME C G F ME U S AF B SV a s c u l a rE n d o t h e l i a lG r o w t hF a c t o rb a s i cF i b r o b l a s tG r o w t hF a c t o rB r o m o p h e n o lB l u eC y c l i nD e p e n d e n tK i n a s eC D KI n h i b i t o rC o n d i
2、t i o n e dM e d i u mD i t l l i o t h r e i t 0 1血管内皮细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子溴酚蓝细胞周期蛋白依赖激酶细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂条件培养液二硫苏糖醇T w o D i m e n s i o n a lE l e c t r o p h o r e s i s双向电泳H U V E CC o n d i t i o n e dM e d i u mH U V E C 条件培养液M 1 9 9w i t h2 0 F B Sa n d2 0 m g LE C G FE n z y m eL i n k e dI n n n u
3、n o s o r b e n tA s s a yF e t a lB o v i n eS e r u m2 0 F B S MM 1 9 9w i t h2 0 F B SF C MH EH U V E Cm C含2 0 F B S 和2 0 m g LE C G F 的M 1 9 9 培养基酶联免疫吸附分析胎牛血清仅含2 0 F B S 的M 1 9 9 培养基F l o wC y t o m e t e r y流式细胞仪H e m a t o x y l i n e o s i n苏木素一伊红H m a nu m b i l i 。8 1V e i nE n d o t l l 。l
4、 i 8 1 人脐静脉内皮细胞 C e l lI m m u n o h i s t o e h e m i s t r y免疫组织化学中田协和医科大学博士学位论文2 英文缩写英文全称中文全称M A L D I TM a R xA s s i s t e dL a s e rD e s o r p t i o nO F M ST i m e o f - f l i g h tM a s sS p e c t r o m e t r yM C F C MM C F 7C o n d i t i o n e dM e d i u mM D A M B 2 31C o n d i t i o n e
5、 d M D A C MM e d i u m M 删wM a r k e r M o l e c u l a rw e i g h tM SM a s sS p e c t r u mM T T3 ( 4 , 5 - d i m e t h y l m i 北。l _ 2 。Y 1 )2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mB r o m i d eP o l y a c r y l a m i d eG e lP A G E E l e c t r o p h o r e s i sP B SP h o s p h a t eB u f f e
6、 r e dS a l i n eP M FP e p t i d eM a s sF i n g e r p r i n tP V D FP o l y v i n y l i d e n eD i f l u o r i d eR bR e t i n o b l a s t o m aG e n e p r o t e i nS K C MS K 小i M CC o n d i t i o n e dM e d i u mT C MT u m o rC o n d i t i o n e dM e d i u mT PT h y m i d i n eP h o s p h o r y
7、l a s e基质辅助激光去解离时间飞行质谱分析M C F 一7 条件培养液M D A M B 一2 3 1 条件培养液标准品分子量质谱3 ( 4 ，5 - 二甲基一2 噻唑) 25 一二苯基溴化四唑聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液肽质量指纹图聚偏乙烯双氟化物视网膜母细胞瘤蛋白S K N M C 条件培养液肿瘤条件培养液胸苷磷酸化酶中国协和医科大学博上学位论文乳腺癌是一种血管新生依赖性的恶性肿瘤，在从原位癌向恶性侵袭性癌进展过程中经历了从无血管新生表型到血管新生表型的转化过程，而且血管新生表型的转化早于恶性侵袭的发生。这提示血管新生表型的转化可能是肿瘤发展中的一个限速步骤，如果能阻止血管新生表型
8、的转化将会有力地抑制肿瘤的发展。关于血管新生表型转化的机理，以往的研究多局限于肿瘤生长过程中释放的促或抑血管新生的因子，对于在促血管新生因子的作用下内皮细胞增殖活性转化的研究较少，而后者才是避开肿瘤血管新生异质性、利用内皮细胞增殖共性来进行抗血管新生治疗的关键。如果能够了解调控内皮细胞增殖活性转化的关键性蛋白因子及其信号转导通路，将有助于我们认识乳腺癌血管新生的机制。血管新生表型在一定程度上取决于内皮细胞的增殖状况，而后者又取决于细胞周期时间、细胞存活与凋亡的比值，特别是细胞周期进程。因为细胞增殖的三个主要部分：细胞生长、D N A 复制和细胞分裂是通过细胞周期而完成的。因而，在检测细胞增殖速
9、率的同时，明确各细胞周期时相内皮细胞数目的变化及细胞凋亡的情况对于了解血管新生进展过程具有重要意义。目前证据显示，控制细胞周期的某些基因或癌基因激活或过表达可以编码某些蛋白质分子，促进细胞增殖，拮抗细胞凋亡。在乳腺癌血管新生中作用较明显的有细胞周期引擎分子c y c l i n C D K 和癌基因H e r2 的产物H E R2 受体蛋白。H e r 2 活化后可以通过M A P K ，P 1 3 一K 等信号转导途径，上调c y c l i nD l 表达，促进G l S 的转化并对癌细胞分泌的促血管生长因子如V E G F 和抑血管因子如T S P 一1 的表达进行调控而实现对皿管新生的
10、调节。由于H E R2 过表达仅发生于2 0 3 0 的乳腺癌病人，因此了解H E R2 通路在无H E R2 过表达的情况下对肿瘤血管新生的调节作用非常重要：而且H E R2 受体表达情况与瘤内微血管密度( M V D )之间的关系也有待进一步的研究。由于肿瘤血管新生中内皮细胞高度增殖活性表型的转化可以解释为一系列蛋白质发生改变以及蛋白质之间相互作用的结果，因此尽可能全面地展示蛋白的变化对于揭示其转化机制无疑具有重要意义。近几年发展起来的蛋白质组学技术，通过尽可能多地提取、分离和展示蛋白质，并结合计算机图像分析技术、生物有机电离质谱技术和生物信息学技术等全面检测组织或细胞蛋白质的表达，为全面
11、研究复杂的病理过程中田擤尊医科大学博士学位论文。4 提供了可能。本研究选择可诱发明显血管颧生的乳腺癌细胞系M D A M B 2 3 l 、M C F 一7 和享申经母细胞瘤细胞系S K ，N M C ，收集肿瘤条件培养液并作用于人脐静脉内皮细胞( U v E e ) ，巍怒察黪瘤缨魄条传培莠液对H U V E C 增殖、躅亡鞠缨瓣周期等细魁生物学行为的影响的同时运用蛋白质组学技术对M D A C M 作用前后的内皮细胞蛋白矮表达进行了魄较。溺时怼乳黥癌组织搽奉送行M V D 、H E R2 表达验捡测，璃察H E R2 受体袁达与血管新生的关系。用M T T 滚测定细胞增疆活力，发琥与2 0
12、 F B S 的基础培养液褶滗，篦串瘤细胞条件培养液可明显促进H U V E C 的增殖，增强细胞增殖活力( P M C F - C M M D A C M 。这提示不同肿瘤缨飚在生长过程巾铎教的促血管内皮细胞生长因予在浓度和弛类上可能不同，这是造成肿瘤血管新生异质性的方面服因。逶遗霹缁熬蠲麓调控蛋鑫豹分板笈瑗，M D A C M 俸爱后豹H U V E C 绥麓中e y e l i nD U E 表达增多，特别是c y c l i nE ，我们推测可能与细胞所处S 期的晚期有关或者c y c l i u嚣谣控通路在M D A C 狱翡餐绥孽鏊蠲期杰整程中发挥圭要作臻。本实验中登自矮维研究结果
13、显示，M D A C M 作用后的内皮细胞中，三种与D N A 转录有关的蛋白质表达发尘变健。A T P 菝赖靛D N A 辩旋酶和H L F 2 表遮增攘，绽迸了D N A 链靛转隶稻筵纬，可维护并促进细胞周期的正常进行。T G I F ，转录因子S m a d 的按阻遏物，表达减弱时促递转泶。这些都蓰示M D A C M 键滋了H U V E C 的D N A 转渌和细熬蹭巯。M D A C M 在导致G l 期的H U V E C 比率下降的同对，也搜分裂翦与分裂期( G 2 M )细胞的比率增简。细胞分裂的顺利进行既有赖于细胞周期蛋白的调控作用，又与影确真丝分裂爨形成豹纲胞嚣架疆自密曩
14、i 可分。本职究中蛋白矮组分瓠维果显示，M D A C M 作用后的一种内皮求源的其促有丝分裂作用的缺氧性应激蛋白e n o l a s e ，1 表达璞热。另羚还发现内攻镪愍中S t o m a t i n 表达明驻一F 薅。S t o m a t i n 可以负性渊竹单价阳离予的膜通透性，与细胞骨架的形成及细胞骨架蛋白质问相作用发捧溺蘩卡葶爱，矮表达泰x F 豹酶低骞可疑耀揍键避绥j 蹩分裂熬遴弦。M D A C M 作用使D N A 合成湖( S 期) 细胞比例明显增犬( P 0 0 5 ) 。这说明H E R2主要是通过影响肿瘤细胞分泌的生长因子来间接促进内皮细胞的增殖，而且可能与乳腺
15、癌发生的细胞种类有关。本实验还发现E C C M 办有较弱的促内皮细胞增殖的作用，其作用强于2 0 F B S M ，但弱于肿瘤细胞条件培养液；E C C M 还可以促进M D A M B 2 3 1 细胞增殖，其作用强于M D A M B 一2 3 1 的基础培养液。这表明肿瘤细胞和内皮细胞在生长过程中可分泌、释放生长因子，相互影响，共| 司促进血管新，L 。此外，本实验还应用蛋白质光学芯片技术对乳腺癌血管新生凼子T P 进行初步研究，为建t + 种快速、简便的临床检测方法进行了初步探索。最近发展的基于椭偏光中田协和医科大学博士学位论文学原理的蛋白质光学芯片具有高通量、高分辨率和集成多元化的
16、特点。以图像形式显示结果直观且可进行定性、定量测定是一种简单、快速和可靠的手段，且不需要像E L I S A 和荧光免疫法那样对待测物作标记，也就不会对待测物的分子活性造成扰动和损伤，操作简单，费用低廉，对蛋白质分子的检测提供了有力的工具。本实验对应用蛋白质光学芯片检测T P 的结果与E L I S A 方法检测结果进行了一致性检验分析，K a p p a 大于O 4 ，P M C F C M M D A C Mw i t hn os t a t i s t i cd i s c r e p a n c ya m o n gt h e m ( P O 5 ) T h i sr e s u l ts u g g e s t st h ef a c to fs e c r e t i o no fg r o w t hf a c t o ra n dt h ep o s s i b i l i t yo fd i f
