《EGF-R、IGF-1-R在胎儿骨髓间充质干细胞体外分化为上皮细胞中的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EGF-R、IGF-1-R在胎儿骨髓间充质干细胞体外分化为上皮细胞中的作用（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学硕士研究生学位论文E G F R 、I G F 1 R 在胎儿骨髓间充质干细胞体外分化为上皮细胞中的作用摘要目的骨髓间充质干细胞( B o n em a r r o w d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，B M S C s ) 具有多向分化潜能。课题组已有实验表明在加入E G F 、I G F 1 等生长因子的条件培养基诱导下B M S C s 能表达C K ，向上皮分化。但B M S C s 何时表达E G F R 和I G F 1 一R 以及该受体与细胞分化为上皮细胞的关系尚未见相关报道。本实验拟测定B M S
2、C sE G F R 和I G F 1 一R 的表达时间；在加入E G F 或I G F 1 诱导后B M S C s 表达E G F R 、I G F 1 R 和C K 的变化；以及加入受体阻断剂后培养的B M S C s 是否还能分化为上皮细胞。拟通过本实验研究E G F 、I G F 1 诱导B M S C s 分化的机制，为B M S C s 在细胞移植治疗以及组织工程研究提供理论依据和实验方法。第一部分胎儿B M S C s 表达E G F 受体和I G F 受体及体外诱导分化1 收集3 5 个月胎龄引产胎儿四肢骨骨髓，分离、培养、扩增获得B M S C s 。比较1 1 1 3 周
3、的标本和2 0 - - 一，2 4 周标本获得的B M S C s 的生长特点。结果：1 3 周以内标本获得的细胞扩增到P 4 时，数量多于2 0 - - 一2 4 周标本；首次传代时间早，衰老出现时间晚。重庆医科大学硕士研究生学位论文2 检测B M S C sE G R R 和I G F 一1 R 出现时间。从P 3 开始，用免疫组织化学染色法每天检测E G F R 、I G F 1 R 的表达。结果显示：E G F R首次表达为P 4 第4 d - P 5 第3 d ；I G F 1 R 首次表达为P 5 第2 d , - , 一p 6 第2 d 。3 分别用E G F3 0 n g m
4、L ，I G F 一15 0n g m L ，E G F3 0n g m L + I G F 15 0n g m L 诱导P 3 一B M S C s ，设立无生长因子对照组，检测E G F R 、I G F 1 R和C K 的表达。结果：E G F 和I G F 1 诱导组细胞表达E G F R 和I G F 1 R较对照组提前2 “ - - - 4 天；C K 表达最早出现在P 4 诱导后2 天，对照组P 6 第4 d 出现微弱的C K 表达。4 用抗E G F R 抗体2 m g m I _ , 或抗I G F - 1 - R 抗体1 5 m g m L 孵育P 5 一B M S C s
5、4 h 后，分别加入含E G F3 0 n g m L 、I G F - 15 0 n g m L 的培养基培养，同时另设4 个对照组：E G F3 0 n g m L ，I G F 15 0 n g m L ，E G F3 0 n g M I + I G F 一15 0 n g m L 和空白对照组。检测E G F R 、I G F 一1 R 和C K的表达。结果：E G F R 和I G F 1 R 阻滞后，第4 d 可检测到C K ，但C K +细胞率和强度均低于加入生长因子诱导组( P 基础医学 医用一般科学 生物医学工程 生物材料学A p p l i c a t i o no fN
6、a t u r a lb i o l o g i c a lm a t e r i a l ss t e n tD u a nJ i a n g - j i e ，W a n gw e i - w e iA b s t r a c t ：N a t u r a lb i o l o g i c a lm a t e r i a l ss t e n th a st h es i m i l a rc h a r a c t e r i s t i c so fe x t r a c e l l u l a rm a t r i xs t r u c t u r ei nt h ec o n s
7、 t i t u t i o na n db i o c o m p a t i b i l i t y , a n ds h o wo b v i o u sa d v a n t a g e sa sc e l l sc u l t u r es t e n ti nt i s s u ee n g i n e e r i n g A m n i t i sw a se a s yt ob eo b t a i n e d ，p r o c e s s i n g ，w i t h o u tt o x i no rs t i m u l u s ，a n dh a sa n t i m
8、i c r o b i a lp r o p e r t i e sa n dt h ep r o m o t i o no ft h eb i o l o g i c a lr o l eo ft i s s u er e p a i r S m a l li n t e s t i n a ls u b m u c o s aw a sn oi m m u n i t y ，c o n t a i n sm a n yk i n do fg r o w t hf a c t o r st op r o m o t et h ea d h e s i o n ，p r o l i f e r
9、 a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nb e t w w e nc e l l sa n dt i s s u e M o r e o v e r , a c e l l u l a rm a t r i x ，s u c ha sb l o o dv e s s e l s ，b l a d d e ra n dc a r t i l a g ew e r eu s e df o rt h er e p a i ro ft i s s u ed e f e c tr e s p e c t i v e l y , e a s yt oa c
10、h i e v et h ec o m p l e t er e g e n e r a t i o no fs t r u c t u r ea n df u n c t i o n T h i sa r t i c l er e v i e w e dt h ea p p l i c a t i o n so fa b o v e - m e n t i o n e ds t e n tm a t e r i a li nt i s s u ee n g i n e e r i n g K e yw o r d s ：t i s s u ee n g i n e e r i n g ；b
11、i o l o g i c a lm a t e r i a l s ；s t e n t重庆医科大学硕士研究生学位论文支架材料是组织工程研究及其临床应用的关键之一。理想的组织工程的支架材料具有以下特点：无毒性，良好的生物组织相容性，不引起机体的免疫排斥反应；有一定孔隙率，良好的表面活性，维持生长其上的细胞形态和表型；具有生物可降解性及降解可调节性，可塑性和一定的机械强度：并能增进细胞的黏附和增殖，诱导组织再生。生物支架材料主要分两大类：天然生物材料( 如脱细胞细胞外基质及胶原等) 和人工合成的可降解材料( 如聚乳酸、聚羟基乙酸及其复合物、聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物等) 。天然生物材料突出的优点
12、在于：生物相容性好，与细胞外基质结构相似，利于细胞的黏附、增殖和分化，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。目前应用较为广泛的生物支架材料有羊膜、小肠粘膜下层，其他的还有兔膀胱无细胞基质、血管脱细胞基质和天然软骨基质等。1 羊膜羊膜( A m n i o t i em e m b r a n e ) 由羊膜上皮、基底膜及基质3 部分组成。具有光滑透明，无血管、淋巴和神经系统，抗原性低，排异反应小，可吸收，易于取材及存储方便等特点。羊膜在组织工程( T i s s u ee n g i n e e r i n g ，T E ) 中作为生物材料负载细胞在实验和临床
13、应用研究越来越广泛。羊膜作为支架多采用去上皮羊膜。去上皮的方法主要有胰蛋白酶E D T A 消化法，去垢剂酶消化法以及氢氧化铵法等，都能较好的去除上皮细胞。基质含有丰富的胶原纤维，疏松地附着到绒毛膜上，使得羊膜易于与绒毛膜剥离。去上皮处理后的羊膜细胞外基质不含有细胞结构，厚的基底膜含胶原( 主要是I 、I V 型胶原) 、糖蛋白和蛋白多糖成分，层粘连蛋白与I V 型胶原结合形成基底膜的骨架，有利于上皮细胞的移行，增加基底上皮细胞的黏附，促进上皮化，防止上皮细胞的凋亡1 1 1 。R T - P C R 和E L A S A 方法显示羊膜表达E G F 、K G F 、H G F 、b F G
14、F 、T G F ( a 、1 31 、1 32 、1 33 ) K G F R 和H G F R 的m R N A l 2 】。羊膜表达的这些生长因子的m R N A 及所包含的几种生长因子的蛋白能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分，有利于细胞的生长繁殖。宋永周等【3 】将大鼠骨髓间充质干细胞接种于去上皮的羊膜上，M T T 法检测羊膜浸提液对骨髓间充质干细胞的细胞毒性，平均相对增值率为8 9 5 ，毒力评分为I 级。将去细胞的羊膜基质植入大鼠皮下，术后1 周，局部以淋巴细胞浸润为主术重庆医科大学硕士研究生学位论文后4 周，基本未见淋巴细胞，部分移植物已经降解。说明羊膜脱细胞基质生物相容性
15、良好。徐梅、刘蕾1 4 5 等将角膜缘细胞接种在完整羊膜和去上皮羊膜上进行体外培养，结果发现接种的细胞在完整羊膜上能更好的维持其特性，但不易贴壁，生长缓慢，很难汇合成片。这可能与完整羊膜的上皮细胞对接种上去的细胞爬行生长造成阻力有关；而在去上皮羊膜基底膜面干细胞能很好的黏附生长、增殖，汇合成片并分层，大部分接种的细胞有不同程度的分化。角膜缘干细胞在去上皮羊膜上生长速度明显快于完整羊膜上，但其在保持干细胞本身特性上低于完整羊膜，他们分析这可能与羊膜上皮本身含有大量的生长因子有关，它们对角膜缘干细胞的生长和维持干细胞特性有利。角膜缘细胞接种在去上皮羊膜上2 周左右可汇合成片，并逐渐分为4 “ -
16、5 层，细胞贴附生长于羊膜上，形态接近正常角膜上皮，呈扁平或立方形。电镜下见细胞内含细胞器，具有大量上皮细胞所含的张力微丝，细胞核呈椭圆形，核膜清晰，基底层细胞较表层细胞高大，且与羊膜之间有半桥粒连接，细胞间可见桥粒连接。M o r i s h i m aY 1 6 】等将几内亚猪的表皮细胞和成纤维细胞共同培养在羊膜上，在刮除假复层上皮细胞后第4d ，移行的扁平上皮细胞分化为立方上皮细胞，第8 d后立方上皮细胞又转变为原来的扁平上皮细胞。在神经修复方面：张琪1 7 1 、M o h a m m a dI S l 等认为羊膜含有重要的嗜神经因子，他们应用复合自体S c h w a n n 细胞的羊膜基底膜管修复大鼠2 5 c m 的坐骨神经缺损，修复后3 个月，神经纤维成功再生，功能恢复达4 0 “ - 6 0 ，再生神经纤维丰富，可与靶肌细胞重建功能性连接。电镜显示羊膜由植入前的纤维编织结构变为均质样基质，其周围富含吞噬
