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1、A Bz “肽疫苗接种老年性痴呆患者体液免疫O N a , l f , E v 疗效A p l - 1 5 肽疫苗接种老年性痴呆患者体液免疫 效应及临床疗效摘要老年性痴呆( A l z h e i m e r Sd i s e a s e ，A D ) 是一种以进行性记忆认知功能下降、言语和行为障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，是痴呆最常见的原因之一。研究证明了A D 在A D 发病机制中的主导作用，近年针对A D 为靶的免疫治疗取得了很大的进步。本课题组已利用多重肽抗原技术( m u l t i p l ea n t i g e np e p t i d es y s t e m
2、，M A P s ) 合成M A P s A D l _ 1 5 肽，配伍T h 2 型佐剂M F 5 9 ，制备成1 1 3 1 - 15 肽疫苗，免疫接种正常S D 大鼠、B A L B e 小鼠、A D 转基因鼠及恒河猴等动物均可有效诱导其产生高滴度的特异性抗A 1 3 4 2 抗体，无不良反应发生，显示出良好的免疫原性和安全性；接种8 例A D 患者可以诱导特异性的免疫反应，同时无明显不良反应发生。国外研究报道A N l 7 9 2 可以诱导人体产生特异性抗体，有效地延缓A D 患者认知记忆功能的下降，减少大脑新皮质内A B 含量；用含有抗A 1 3 抗体人静脉用免疫球蛋白( i n
3、t r a v e n o u si m m u n o g l o b u l i n ，i v o ) 治疗6 例A D 患者，可以轻度改善患者的认知功能。目前国外有主动免疫及被动免疫共5 个药物正在进行临床试验【l J 。本实验在前期动物及临床研究的基础之上，进一步评价A 3 l _ 1 5 肽疫苗对A D 患者的体液免疫效应及临床疗效。正电子发射计算机断层摄影( P o s i t r o nE m i s s i o nT o m o g r a p h y , P E T ) 利用解剖形态方式进行功能、代谢、受体及基因显像的一种医学影像技术，具有很高的灵敏度和空间分辨率，可以从体外
4、无损伤、定量、动态地测定“c ，N ，邙“s 肽疫苗接种老年性痴呆患者体液免疫效应及临床疗效”O ，1 8F ( 性质类似于氢) 等“有机的”正电子核素标记药物或其代谫f 分子在活体内的空间分布、数量及其时间变化，从分子水平上反映活体内的生理、生化变化特点，精确地、定量地显示各部位组织的微观结构及动态变化。”F - F D G P E T 显示A D 患者脑内葡萄糖代谢明显下降，而且下降的程度与临床认知功能的变化具有相关性，是评价A D 疾病进展情况及药物疗效非常敏感的指标，因此本研究将该法用于评价A B I _ 1 5 肽疫苗的临床疗效。1 临床资料材料和方法选取2 0 0 4 年4 月至2
5、 0 0 6 年4 月在广东省南海福利中心住院的轻至中度A D患者1 6 例，其中男6 例，女1 0 例；年龄6 0 8 0 岁，年龄平均( 6 5 2 4 - 86 ) 岁，病程2 5 年，符合美国国立神经病学传染病及卒中研究所与阿尔茨海默病和相关病协会( N I N C D S A D R D A ) 的诊断标准。所有患者均由两位神经内科医师做出诊断。未合并使用他汀类降脂药、非甾体类抗炎药、胆碱脂酶抑制剂、雌激素等。简易精神状态量表( M i n i m e n t a ls t a t ee x a m i n a t i o n ，M M S E ) 、日常活动量表( A c t i
6、v i t yo f d a i l yl i f e ，A D L ) 及修定的长谷川智能量表( H a s e g a w a SD e m e n t i aS c a l e R ，H D S - R ) 评价患者认知行为功能状态，L o e b 改良缺血量表除外血管性痴呆，H a m i l t o n 抑郁量表除外抑郁症。受教育程度：文盲4 例，小学4 例，中学以上学历8 例。所有研究对像均为右利手，均排除高血压、糖尿病、精神病史、酒精或药物滥用、肿瘤及自身免疫性疾病等。在T 1 液体衰减反转恢复序列( f l u i da t t e n u a t e di n v e r s
7、 i o nr e c o v e r y ，T 】一F L A I R ) , f 口T 2 - F L A I R 序列检查中出现直径大于5m m 的高信号灶或直径小于5m m 但数量超过4 个者被排除在研究对象之外2 疫苗的制各及接种利用M A P s 技术，将A 1 3 , 15 与七聚赖氨酸( M A P ) 连接制备成M A P A B 5抗原肽。M A P A 3 1 1 5 用O 0 Im o l LP B S ( p H74 ) 溶解，于3 7 。C 孵育过夜，置4o C 保存。M F 5 9 用S q u a l e n e ，T w e e n 8 0 ，S p a n
8、8 5 和双蒸水按5 ：0 5 ：05 ：9 4 ( v ：v ) 的比例，以高速均浆器混合，使悬滴直径达l 1 0 9 m ，然后用l l O Y 型微流体化仪在6I I邮- “肽疫苗接种老年性痴呆患者体液免疫效应及r 临床疗效0 0 01 20 0 0 p i 2 高压下，经5 个循环进一步乳化成小悬滴，用O 2 2 p m 滤膜过滤分装，置4 。C 保存。临用前将M A P A B l - 1 5 与M F 5 9 按1 ：1 ( v ：v ) 的比例混合，即为接种用疫苗，双侧鼻粘膜接种( 接种前，消毒棉签清理鼻腔：患者取仰卧位，头后仰，以防止疫苗流出鼻外) ，便携式喷雾器喷入。每次接种
9、1 5 0ul ，每侧鼻腔各7 5 “l ，含抗原量2 0 0P - g ，每次接种后，轻揉双侧鼻翼，床边观察1 5 分钟，确保疫苗吸收进鼻黏膜。每月一次，共接种1 0 次，疗程1 0 个月。3A l l u s 肽疫苗接种A D 患者的体液免疫效应本组研究患者均为广东省南海福利中心长期住院的疗养老人，治疗前均取得相关伦理机构、患者家属或本人及福利中一t l , 领导的知情同意，中心的护士及医生均配合本课题的进行，观察临床疗效及不良反应并进行相关的化验检查，可以顺利完成本课题的各项要求。每次疫苗接种前采血1 次，全部接种完成后，继续采血2 次，共采血1 3 次。每次采血量均为3 m L 。间接
10、E L I S A 法检测血清中抗A B 4 2 抗体的水平；W e s t e r nb l o t 方法检测血清抗A t 3 4 2 抗体的特异性；E L I S A 桥联法检测血清抗A B 4 2I g G 亚类；双抗体夹心E L I S A 法测定A D 患者血清中A 6 4 2 的含量变化；免疫组化A B C法观察血清抗A l l 4 2 抗体与A D 转基因小鼠脑组织内的老年斑结合情况。4 A l l “s 肽疫苗接种A D 患者认知功能变化用M M S E 、A D L 及H D S R 观察治疗前后A D 患者记忆认知功能及日常活动能力的变化。5 用“F - F D G P E
11、 T 评价脑内葡萄糖代谢的变化。采用半定量方法，启动P E T 系统的感兴趣区( R e g i o no fi n t e r e s t ，R O I ) 程序，选定R O I ，由计算机系统自动测定每个R O I 内的平均放射性浓度( 单位为M B q m 1 ) ，根据R O I 设定图，将不同层面上相同脑区的放射性浓度取平均值作为这个脑区的平均放射性，以N N I j , 脑半球的平均放射性的平均值作参考，分别将各R O I 的平均放射性与小脑半球的平均值相比所得的比值，作为评价脑局部葡萄糖代谢率( r C M R g t c )的半定量方法。H IA D “s 肽疫苗接种老年性痴呆
12、患者体液免疫效应及临床疗效6A B l _ 1 5 肽疫苗接种A D 患者的安全性评估严密观察A t a , 小肽疫苗接种后的局部以及全身不良反应，睡眠、体重、饮食及精神状态等；生命体征及常规实验室检查( 血液生化检测、血常规、尿常规等) 进一步对其安全性进行评估。结果IA B - - 5 肽疫苗接种A D 患者的体液免疫学效应第1 次及第2 次疫苗接种后检测，体内抗体增加不明显。第3 次疫苗接种后血液中的抗A D 4 2 抗体含量明显增加，达到3 5 3ug m l ，几乎到达峰值( 3 9 4 ug m 1 ) 。第4 次以后接种，抗体的增加幅度不明显，维持在一个较高的水平。第1 0 次接
13、种后，为了观察抗体的变化，暂停接种，但抗体含量仍然维持在较高的水平，直至观察结束。W e s t e r nb l o t 显示，在G S T 邱4 2 的结合位置处，疫苗接种后的A D 患者血清及阳性对照在3 0 K d 处均有一条结合蛋白条带，参照标准蛋白M a r k e r ，可以推知该条带为G S T 邸4 2 的结合位置。此结果表明，血清抗A p 4 2 抗体具有高度的特异性。桥联E L I S A 检测的结果表明，在A D 患者的血清中，接种后的抗邰4 2 抗体的I g G 均以l g G l 和l g G 2 为主。以I g G l 的水平最高，其后依次为I g G 2 、I
14、g G 3 和I g G 4 ，I g G 2 I g G l 0 0 5 ) 。免疫组化染色结果表明，疫苗接患者血清中的抗A B 4 2 抗体能与T 9 2 5 7 6 转基因小鼠脑组织内的A p 斑结合。光镜下观察A p 斑的形态，可见转基因小鼠脑组织内的A B 斑被染成棕色或棕褐色，呈圆形、椭圆形或不规则形，有的中心密度较低，有的较为均质；此外，还可见多个散在的A 6 沉积：疫苗接种前的患者血清不能染色出T 9 2 5 7 6 转基因小鼠脑组织内的A B 斑。2A p “5 肽疫苗接种A D 患者认知功能变化治疗前后M M S E 评分分别为( 1 4 6 3 - k 4 6 0 ) 、
15、( 1 3 6 9 ：1 ：45 1 ) ，无显著性差异( J D = 0 4 4 ) 。治疗后评分与治疗前相比变化范围为( 6 2 5 土1 2 6 ；一2 2 分) ，I VA B “s 肽疫苗接种老年性痴呆患者体液免疫效应及临床疗效而在A D 患者自然病程中，M M S E 评分每年下降约为( 3 9 土3 7 ) 分。治疗前后A D L 积分分别为( 3 2 6 2 - 4 - 6 7 5 ) 、( 3 2 5 - 4 - 5 9 1 ) 分，无显著性差异泸= 0 8 5 ) 。与治疗前相比，变化范围为( 一1 3 士2 6 8 ，6 5 ) 分，而未经治疗的患者，A D L 评分每年
16、升高约( 一8 7 l O ) 分。治疗前后H D S R 评分分别为( 1 48 1 4 - 4 4 9 ) 、( 1 4 - 6 3 + 3 ，6 5 ) 分，无显著性差异( ，= 0 ，6 8 ) ，与治疗前相比，变化范围为( 1 9 + 1 8 0 ，4 2 ) 分，而未经治疗的患者，H D S R 降低约( - - 3 5 3 8 ) 分。从以上结果可以发现，本组患者的临床表现明显不同于A D 的自然病程，认知功能下降的速度较A D 的自然下降率明显减慢。进一步对M M S E 及H D S R 认知功能评分升高( 升高范围l 3 分) 的4 例患者量表的子项目分析发现，评分增高的部分主要集中在时间、空间定向方面的改善，其次为短时记忆方面的改善，但是由于该组患者样本量较小，并不具有统计学意义。因此，这种改善是否有临床意义，仍然需要进一步观察。3A D 患者治疗前后相关脑区葡萄糖代谢的变化”F - F D G P
