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1、DNA 浓度和纯度的测定一、原理DNA 或 RNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。 波长为 260nm 时， DNA 或 RNA 的光密度 OD260 不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1g / ml 时， DNA 钠盐的 OD2600.02 当 OD2601 时，dsDNA 浓度约为 50g / ml ssDNA 浓度约为 37g / ml RNA 浓度约为 40g / ml 寡核苷酸浓度约为30g / ml（youyu 底物不同有差异）当 DNA 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA 吸光度的准确测定。一般情况下同
2、时检测同一样品的OD260、OD280 和 OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯 DNA ：OD260 / OD2801.8 (1.9,表明有 RNA 污染； 1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯 RNA：1.7 OD260 / OD2802.0 （ 1.7 时表明有蛋白质或酚污染； 2.0 时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯， 则比值发生变化， 此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。二、材料、试剂及器具1、材料提取的 PUC19 样品、 PUC19标准样品2、试剂灭菌重蒸水， TE 缓冲液3、器皿石英比色皿； UV-240 紫外分光光度计二、
3、实验步骤1、UV-240 紫外分光光度计开机预热10min. 2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE 缓冲液后，放入样品室的 S 池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA 5l 或 RNA 4l 用 TE 缓冲液稀释至 1000l）后，记录编号和稀释度。5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S 架上，关闭盖板。6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm 波长时的 OD 值。7、计算待测样品的浓度与纯度。DNA 样品的浓度（ g / l）:OD260稀释倍数 50/1000 RNA 样品的浓度（ g / l） ：OD2
4、60稀释倍数 40/1000 方案二 溴化乙锭法一、原理溴化乙锭（ EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或 RNA 链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA 吸收 254nm的紫外辐射并传递能量给EB，而 EB 本身在 302nm 和 366nm处有光吸收。 吸收的能量在 590nm处释放，并表现为橙红色荧光。 结合的 EB 的荧光产率远大于游离EB 的荧光产率。EB 结合量的多少与DNA 的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA 样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA 含量成正比。二、材料、试剂及器
5、具1、 标准 DNA 样品: 已知浓度的线型 DNA ，以 TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。2、 质粒 DNA 的酶切样品（待测）3、 溴化乙锭（ EB ）5g / ml ：以 PH8.0的 TE稀释 10mg/ml 母液而的。4、 紫外透射仪。三、操作步骤黑色塑料板（或其他替代物）在其上点上两排溴化乙锭2l 液滴，每排六点取标准样品 2l 与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA 浓度分别为（单位： ng/ l ）:20 、15、10、5、2、1 取待测样品经过梯度稀释后，各加2l 于第二排的溴化乙锭上混匀梯度稀释（单位： l ）把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上关好样品室门。以短波紫外光
6、激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度四、注意事项1、 标准样品含单一种类的DNA ，且大小与待测样品相近。2、 待测样品和标准样品使用同样的体积. 3、 EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。4、 沾有 EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。五、实验报告1、 绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度）2、 请估算待测 DNA 原液的浓度。要求记录测定原始数据， 计算待测样品的浓度和纯度； 并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想。琼脂糖凝胶电泳检测DNA采用1%的琼脂糖进行电泳，实
7、验步骤为: a. 制胶：称取 0.2g琼脂糖转入三角瓶中，加入20mL 1 TAE，混匀，于微波炉中加热融化。稍冷却后，加入1 L EB溶液（ 10mg/mL），倒入预先插入梳子的凝胶槽（ 12cm 12cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；b. 上样：在水平电泳槽中加入1 TAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽（HE-120，上海天能科技有限公司）中，保证缓冲液的液面高于凝胶表面。在封口膜上将 5 L DNA 样品和 1 L 6 loading buffer混合均匀， 然后小心的加入到凝胶的点样孔中。 Marker为 DNA/Hind III ，上样量为 5 L。c. 跑胶：确认样品孔所在的一侧为阴极， 打开电泳仪（EPS-300， 上海天能），设定电压为 85V进行跑胶。d. 凝胶成像：待溴酚蓝迁移到终端时停止电泳。在凝胶成像系统（Bio-rad GelDoc XR，美国伯乐公司）的紫外光下观察并拍照。
