《RNA干扰iRNA技术及其应用》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNA干扰iRNA技术及其应用(7页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、RNA干 扰 iRNA 技 术 及 其 应 用 摘 要 : RNA 干 扰 (interference RNA, iRNA) 是 正 常 生 物 体 内 抑 制 特 定 基 因 表 达 的 一 种 现 象 , 它 是 指 当 细 胞 中 导 入 与 内 源 性 mRNA编 码 区 同 源 的 双 链 RNA时,该 mRNA发 生 降 解 而 导 致 基 因 表 达 沉 默 的 现 象 , 这 种 现 象 发 生 在 转 录 后 水 平 ,又 称 为 转 录 后 基 因 沉 默 。 RNA具有 特 异 性 和 有 效 性 。 iRNA 技 术 作 为 功 能 基 因 组 学 强 有 力 的 研
2、究 工 具 , 可 以 特 异 地 使 特 定 基 因 沉 默 ,获 得 功 能 丧 失 或 降 低 突 变 。随 着 对 现 代 分 子 生 物 学 研 究 的 发 展 ,该技 术 的 应 用 领域 逐 步 扩 展 到 医 学 ,农 业 ,林 业 , 渔 业 ,畜 牧 等 多 个 领 域 ,具 有 巨 大 的 科 研 ,经 济 和 社 会 价 值 ,本 文 主 要 论 述 RNA干 扰技 术 在 医 学 领 域 方 面 的 应 用 。 关 键 字 : RNA 干 扰转 录 后 基 因 沉 默RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物 正 文 :今 年 来 ,对 RNA干 扰 技 术 的 研 究
3、已 经 成 为 热 点 ,预 测 未 来 10 年 间 最 后 可 能 出 重 要 成 果 的 领 域 之 一 , 并 被 Science 评 选 为 2002 年 度 最 重 要 科 技 突 破 的 首 位 。 RNA干 扰 技 术 之 所 以 有 如 此 重 要 的 地 位 , 与 其 运 用 到 的 领 域 有 关 。 21 世 纪 初 , 人 类 完 成 了 基 因 组 计 划 , 破 译 人 类 全 部 的 遗 传 信 息 ,使 人 类 第 一 次 在 分 子 水 平 上 全面 认识 自 我 。因 此 ,很 多 疾 病 的 病 因 也 将 揭 开 神 秘 的 面 纱 ,这 位 这 些
4、 疾 病 的 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 奠 定 了 基 础 。因 此 ,利 用 RNA干 扰 技 术抑 制 基 因组 的 基 因 表 达 的 技 术 手 段 ,有 可 能 在 基 因 治 疗 方 面 开 辟 一 条 心的 途径 ,克 服 医 学 上 许 多 疑 难 杂 症 ,例 如 ,病 毒 性 疾 病 ,肿 瘤 心 血 管 疾 病 和 遗 传 性 疾 病 。 1.RNA 干 扰 的 发 现 : 首 次 发 现 dsRNA 能 够 导 致 基 因 沉 默 的 线 索 来 源 于 线 虫 Caenorhabditis elegans的 研 究 。 1995 年 , 康 乃 尔 大 学
5、的 Su Guo博 士 在 试 图 阻 断 秀 丽 新 小 杆 线 虫 (C.elegans)的 par-1基 因 时 , 发 现 了 一 个 意 想 不 到 的 现 象 。她 们 本 想 利 用 反 义 RNA技术 特 异 性 地 阻 断 上 述 基 因 的 表 达 ,而 同 时 在 对 照 实 验 中 给 线 虫 注 射 正 义 RNA以 期 观 察 到 基 因 表 达 的 增 强 ,但 得 到 的 结 果 是 二 者 都 同 样 地 切 断 了 par-1基 因 的 表 达 途 径 。这 是 与 传 统 上 对 反 义 RNA技 术 的 解 释 正 好 相 反 。该 研 究 小 组 一
6、直 未 能 给 这 个 意 外 以 合 理 解 释 。这 个 奇 怪 的 现 象 直 到 3 年后 才 被 解 开 。 1998 年 2 月 , 华 盛 顿 卡 耐 基 研 究 院 的 Andrew Fire和 马 萨 诸 塞 大 学 癌 症 中 心 的 Craig Mello才 首 次 揭 开 这 个 悬 疑 之 谜 。通 过 大 量 艰 苦 的 工 作 , 他 们 证 实 , Su Guo博 士 遇 到 的 正 义 RNA 抑 制 基 因 表 达 的 现 象 ,以 及 过 去 的 反 义 RNA技 术 对 基 因 表 达 的 阻 断 ,都 是 由 于 体 外 转 录 所 得 RNA中污 染
7、 了 微 量 双 链 RNA而引 起。当 他 们 将 体 外 转 录 得 到 的 单 链RNA 纯 化 后 注 射 线 虫 时 发 现 , 基 因 抑 制 效 应 变 得 十 分 微 弱 ,而 经 过 纯 化 的 双 链 RNA却 正 好 相 反 ,能 够 高 效 特 异 性 阻 断 相 应 基 因 的 表 达 。实 际 上 每 个 细 胞 只 要 很 少 几 个 分 子 的 双 链 RNA已经 足 够 完 全 阻 断 同 源 基 因 的 表 达 。后 来 的 实 验 表 明 在 线 虫 中 注 入 双 链 RNA不单 可 以 阻 断 整 个 线 虫 的 同 源 基 因 表 达 ,还 会 导
8、致 其 第 一 代 子 代 的 同 源 基 因 沉 默 ,该 小 组 将 这 一 现 象 称 为 RNA干 扰 。现 在 RNA干 扰现 象 广 泛 存 在 于 从 植 物 、真 菌 、线 虫 、昆 虫 、蛙 类 、鸟 类 、大 鼠 、小 鼠 、猴 一 直 到 人 类 的 几 乎 所 有 的 真 核 生 物 中 细 胞 , 这 种 情 况 揭 示 了 iRNA 现 象 很 可 能 出 现 于 生 命 进 化 的 早 期 阶 段 。后 来 在 果 蝇 细 胞 中 的 实 验 进 一 步 揭示 这 个 秘 密 。 在 一 系 列 著 名 的 实 验 中 , Zamore 和 同 事 发 现 注 入
9、 果 蝇 细 胞 的 dsRNA 被切 割 为 21 23 碱 基 长 短 的 RNA片 段 ,他 们 同 时 发 现 : 与 dsRNA 同 源 的 内 源 基 因 的 mRNA , 只 在 和 dsRNA 对 应 的 部位 被 切割 成 为 21 23 核 苷 酸 长 的 片 断 。 很 快 , iRNA 的 机 制 越 来 越 清 楚 了 。2.iRNA干 扰 作 用 机 制 :iRNA 的 作 用 体现 在 两 种 水 平 上 。 转录 水平 。 RNA 可 以 介 导DNA 的 甲 基 化 最 早 发 现 于 一 种 植 物 的 类 病 毒系 统 。dsRNA 被 降 解 成 21
10、23 个 核 苷 酸 长 的 小 片 段 RNA 时 ,这 些 小的RNA 分 子 在 细 胞 核 可 以 诱 发 同 源 序 列 的DNA 甲 基 化。这 种 序 列特 异 性 的 甲 基 化 的 信 号 与RNA-DNA 结 合 有 关。 当dsRNA 含 有 与 启动 子 同 源 的 序 列 ,即 可 使 同 源 靶 启 动 子 序 列 甲 基 化 ,从 而 使 靶 启 动 子失 去 功 能 , 导 致 下 游 基 因 沉 默 。 转 录 后 水 平 。 (1) 特 异 切 割dsRNA 的 RNA 酶 家 族 核 酸 酶 Dicer 依 赖 ATP 切 割 dsRNA ,将 其分 解
11、成具 有 2 个 核 苷 酸 的 3 端的 19 21b 小 片 段 的 双 链siRNA 。(2)RISC(RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物 ) 识 别 并 降 解 mRNA 。RISC 是 一 种 蛋白 -RNA 效 应 器 核 酸 酶 复 合 物 。 双 链 siRNA 为 RISC 的 重 要 组 分 ,它依 赖 ATP 解 旋 导 致 RISC 活 化 , 然 后 通 过 Waston-Crick 碱基 配 对 识别 底 物 mRNA 并 与 之 结 合 , 并 自 siRNA 的 3 端 将 mRNA 切割 成 小 于12nt 的 片 段 使 其 降 解。对一 些 人 组 织
12、 因 子 的 试 验 表 明 ,几个 不 同 的siRNA 可 以 攻 击 同 一 个mRNA 的 不 同 位 点 。 只 有 一 部 分siRNA 会 导致 显著 的 基 因沉 默 , 这 说 明 在 人mRNA 上 的siRNA 结 合 位 点可 能 很少 , 且 不 活 跃 的 siRNA 与 活 跃 的 siRNA 可 逆 性 竞 争 。 并 且RNAi 干扰 现 象 具 有 以 下 几 个 重 要 的 特 征 : ( 1) iRNA 是 转 录 后 水 平 的 基 因 沉默 机 制 ; (2)iRNA具 有 很 高 的 特 异 性 ,只 降 解 与 之 序 列 相 应 的 单 个 内
13、源 基 因 的 mRNA ;(3)iRNA抑 制 基 因 表 达 具 有 很 高 的 效 率 ,表 型 可 以 达到 缺 失 突 变 体 表 型 的 程 度 ,而 且 相 对 很 少 量 的 dsRNA 分子 就 能 完 全 抑制 相 应 基 因 的 表 达 ,是 以 催 化 放 大 的 方 式 进 行 的 ; (4)iRNA抑制 基 因表 达 的 效 应 可 以 穿 过 细 胞 界 限 ,在 不 同 细 胞 间 长 距 离 传 递 和 维 持 信 号甚 至 传 播 至 整 个 有 机 体 以 及 可 遗 传 等 特 点 :(5)dsRNA不 得 短 于 21 个碱基 , 并 且 长 链 ds
14、RNA也 在 细 胞 内 被 Dicer酶 切 割 为 21 bp 左 右 的 siRNA ,并 由 siRNA 来 介 导 mRNA切 割 。 而 且 大 于 30 bp的 dsRNA 不能 在 哺 乳动 物 中 诱 导 特 异 的 RNA干扰 , 而 是 细 胞 非 特 异 性 和 全 面 的 基 因 表 达 受抑 和 凋 亡 ; (6)ATP依 赖 性 : 在 去 除 ATP 的 样 品 中 RNA干 扰 现 象 降 低或 消 失 显 示 RNA干 扰 是 一 个 ATP 依 赖 的 过 程 , 可 能 是 Diecer和 RISC的 酶 切 反 应 必 须 由 ATP 提供 能 量 。
15、3.RNA 干 扰 的 应 用 :RNA 干 扰 现 象 的 发 现 及 其 在生 物 中 存 在 的普 遍 性 ,以 及 RNAi 作 用 机 制 和 生 物 学 功 能 的 初 步 阐 明 ,为 RNAi 的 应用 提 供 了 理 论 基 础 。 RNAi 目 前 已 经 在 功 能 基 因 组 学 研 究 、 微 生 物 学研 究 、 基 因 治 疗 和 信 号 转 导 等 广 泛 的 领 域 里 取 得 了 令 人 瞩 目 的 进 展 ,使 其 在 医 学 领 域 包 括 动 物 医 学 领 域 在 内 的 应 用 有 着 广 阔 的 前 景 。(1)研 究 基 因 功 能 的 强 有
16、 力 工 具 。 随 着 人 类 基 因 组 序 列 的 完 全 破译 , 人 类 一 进 入 后 基 因 组 时 代 。 在 人 类 基 因 组 的 30 亿个 碱 基 对 当 中 ,蛋 白 质 编 码 基 因 只 有 3-4 万 个 , 但 约 半 数 的 基 因 功 能 为 知 。 弄 清 这 些基 因 的 功 能 及 其 相 关 作 用 关 系 已 迫 在 眉 睫 ,建 立 一 种 高 效,快 捷 ,简单 的 确 定 基 因 功 能 的 新 技 术 是 各 国 学 着 梦 寐 以 求 的 愿 望 。 由 于iRNA具 有 高 度 的 序 列 专 一 性 ,可 以 特 异 地 使 特 定 基 因 沉 默 ,获 得 功 能 丧 失或 降 低 突 变 ,目 前 , iRNA 技 术 作 为 功 能 基 因 组 学 强 有 力 的 研 究 工 具 。已 有 研 究 表 明 iRNA 能够 在 哺 乳 动 物 中 抑 制 特 定 基 因 的 表 达 , 制 作 多种 表 型 ,而 且 抑 制 基 因 表 达 的 时 间 可 以 控 制 在 发 育 的任