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1、1 细胞冻存与复苏技术概述细胞培养技术自1907 年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。 在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0 196 oC 进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度， 并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20-40 冰箱保存、 -60-80深低温冰箱和液氮 (一 196 )超低温保存等。应用方向1. 医学方面近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的
2、多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。2. 生物学方面细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。发展历史1. 1776 年 Spa
3、llanzani 最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani 相似的结论。即“冷不能杀死精子”。3. 1900 年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。4. 二十世纪50 年代Luyet 等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基2 本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。5. 1972 年 Mazur 等首先根据
4、中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏， 导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被
5、称为溶液损伤 (Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。目前低温医学生物学对温度的界限尚无明确规定，一般将温度降至0 -200时，统称为冷冻或低温。冷冻有两种截然不同的生物学效应：一是维持细胞生命，达保存组织的目的；二是促使细胞坏死，达破坏组织的目的。影响细胞生死的主要因素，可以归结为：（1）冷却的温度和速度； （2）复温速度；（3）组织细胞对低温感受性；（4）冷冻保护剂、冷冻免疫增强效应和佐剂（免疫强化剂）。这些因素决定着细胞和组织的命运。冷冻对组织细胞杀伤的主要机理尚未完全明暸，目前认为是多种因素综
6、合作用的结果，这些因素是； 细胞内外冰晶的机械性挫伤，细胞内电解质毒性浓缩、细胞膜受损直至破裂、温度休克、血流郁滞与微血管栓塞致使细胞缺氧而死亡等。（一）相变制冷指利用致冷剂物态变化（液体蒸发、固体熔解或升华）的物理过程而达到制冷的目的。凡溶点、升华点和沸点温度低的物质均可作制冷技术中的致冷剂。（1）熔解过程（固态变液态）如盐冰冷剂。 （2）升华过程（固态变气态）如固体二氧化碳（干冰）。 （3）蒸发过程（液态变气态）如作表面麻醉用的氯乙烷等。医用制冷设备中常用的致冷剂有：二氧化碳，氟里昂和液态氮等。在相变制冷式冷冻治疗器中，目前临床广泛采用的是液氮冷冻治疗器，有手持式、 软管式和双相传输式液氮
7、冷冻治疗器，液氮浸冷式冷刀及特种冷刀，以及自增压杜瓦连体式医用冷刀等，其结构、体积、管道系统、杜瓦瓶等不断改进，并设有专科用系列冷头，还配备测温、定温、复温、监视和记录温度等自控装置。（二）气体膨胀制冷（等焓膨胀制冷）使压缩气体迅速通过阀门孔隙以降低压力的方法称为节流。气体在节流膨胀时，改变自身温度（冷却或加热）的现象称为焦耳汤姆逊效应，是气体节流膨胀制冷的基本原理。医疗上一般采用的氧气节流式冷冻治疗器，是一内装微型焦耳汤姆逊效应的笔形制冷器。由冷头与人体组织进行热交换，使组织冻结。（三）热电效应制冷（半导体制冷）把任何两种不同的导体焊接起来构成一个闭合电路，输入一定电流后， 在不同导体的两个
8、接3 点间就产生了温度差，当电流向某一方向流过时，接点发热，当电流方向相反时，该接点则变冷。此现象称为帕尔帖效应，在半导体焊接的回路中最明显，故又称半导体制冷。可用多级串连法制成半导体制冷器，但极数增加则体积加大，不便临床使用。目前多为12 级半导体制冷器，可用于眼科、耳鼻喉科等。低温贮藏、低温贮藏是使生物物质在冷冻假死状态下保存生命力的一种方法。近年来在理论和应用方面都有较大的进展，已应用于许多方面。1细胞贮存低温贮存细胞比细胞培养传代优越，可避免遭受污染和繁殖活力的丧失。血液细胞：红细胞回复率已可达8595；白细胞中以淋巴细胞回复率最高；血小板回复率可达 4297。骨髓干细胞回复率可达65
9、 100。精、卵细胞回复率可达98 99。2 组织贮存皮肤冷藏后活力高，优于不冷藏者。 角膜在深低温下保存时间平均可达2 个月，在 4下保存须于48 小时内使用，胰岛冷藏复温后，其分泌量约达冷藏前的5075。硬脑膜经冷冻干燥保存后，移植效果更好。3器官贮存狗肾脏冷藏、移植实验已经成功。大鼠心肺整块摘除冷藏2 年复温后，心脏可重新跳动。4胚胎贮存低温贮存的胚胎，已可供导地运送和移植。5人体贮存即人生命贮存。今天患有不治之症的病人，希望贮藏起来，若干年能治愈时，再复苏治疗。于是人体保存应运而生。美国、法国等已建立了冷冻活人的机构，据报道现已低温贮存100 多人。法国声称将于2000 年复活一位脑瘤
10、患者，人们正拭目以待。超低温医学简况(了解 ) 液氦温区三个特殊的物理效应在现代医学中的应用，带来了超低温医学的发展。（一）超导效应在医学中的应用利用液氦冷却的超导磁场技术，已研制成以下几种设备：（1）超导 介子加速器：用于治疗恶性肿瘤，取得了比一般放射治疗更好的疗效；（2）小型超导磁铁系统：临床已对舌癌治疗成功，对脑、肾肿瘤亦取得预期效果，对肺、肝、甲状腺等恶性肿瘤的治疗亦很有成功希望； （3）高分辨率核磁共振波谱仪：不仅生物学和生物医学中获得重要应用，还可用于肿瘤标本的快速鉴别。（二）超流效应在医学中的应用真空超紫外激光器即是4He 的超流效应在医学中的最新应用，正用于生物医学、分子反应等方面。（三）超导隧道效应在医学中的应用超导强磁计即是根据超导隧道效应这一原理制成的超导量子干涉器件（SQUID ）在医学中的应用。将超导强磁计置于病人身边，即可接收到心脏、 脑和肌肉所产生的极微弱的磁声信息，而输出心磁图、脑磁图、肌磁图。灵敏度高，可以诊断微小病变，对病人无害，无痛苦。氩氦刀治疗现状欧美无创或微创的超低温手术所取得的成就，主要得益于美国恩多凯尔公司最新研制成功的氩氦超导手术系统。这个具有多探头、高精密度、快速冷冻的发明，代表国际上九十年代超低温冷冻仪器的先进水平，也引起超低温手术和肿瘤治疗的革命。
